目的:BRAF突变黑色素瘤的小分子靶向疗法虽然早已经广泛应用于临床,但是半数以上初期对药物敏感患者很快发生获得性耐药,且耐药机制尚不十分清楚。为了探究黑色素瘤靶向小分子耐药过程中的分子水平变化和潜在调控机制,以期寻找到可以用于早期预示耐药表型发生或疗效评估的分子标志。方法:1、运用分子克隆将以化学法合成、PCR扩增的含19个随机碱基的人工合成小调节RNA文库（short aritifical modulatory RNA,SAM-RNA）,又称N19文库插入携带逆转录病毒表达元件的质粒p SOK,并通过PCR、测序等手段对文库序列多样性和深度、广度进行评价。2、利用携带BRAF突变的黑色素瘤细胞Mel-888和Mel-624构建稳定表达N19文库的稳定细胞系,然后以浓度递增的维罗非尼进行获得性耐药细胞筛选,通过体内外实验、组织学染色等方法表征细胞的治疗反应性和恶性程度;通过Q-PCR、高通量测序、生物信息学等方法检测耐药文库细胞Mel-888 N19和Mel-624 N19内基因改变,构建基因SNV-mi RNA调控关系。3、提取N19文库中单个特征序列,并构建稳定细胞系进行耐药筛选;通过形态学、组织学染色鉴定表达不同特征序列的稳定细胞系对维罗非尼的治疗抵抗。结果:1、通过Gibson Assembly法一轮构建的N19文库可表达106数量级的短链随机序列,随机测序结果无重复,表明序列多样性跨度大,足以覆盖人类全基因组。2、两株黑色素瘤细胞Mel-888和Mel-624对维罗非尼的初始敏感浓度较为一致,二者半数致死浓度范围约5～10μM。3、Q-PCR检测到Mel-888 N19和Mel-624 N19文库耐药细胞内MAPK信号通路、上皮–间质转化（EMT）、耐药相关基因水平存在较大差异。MAPK信号通路相关分子NRAS、BRAF、RAF1在两细胞系中呈上调趋势,而MEK1、2略有下降。EMT标志分子VIM、SNAIL1、SNAIL2、TWIST1、MMP14表达增加,OCLN、FOXC2、CDH2等表达降低。4、序列比对结果显示,N19文库与人类基因组编码和非编码基因序列正、反义链不存在完全同源分布现象,超过60%的N19序列出现至少4个碱基错配。5、外源性引入N19加剧耐药筛选进程中的黑色素瘤细胞基因组不稳定性。外显子测序结果显示,获得性耐药过程中Mel-888 N19和Mel-624 N19组中携带新发现SNV的特异基因49个,对应SNV频次96个。差异基因KEGG通路分布与亲代显著不同,差异通路（P<0.05）中超过二分之一发生改变。6、生物信息学分析发现,耐药筛选过程中N19文库细胞内mi RNA-SNV结合关系发生改变。外显子区域单碱基变异促使mi RNA-SNV调节网络形成新的交互联结超过1000对。差异mi RNA表达谱Ontology分布由代表性的Hippo signaling pathway、Oocyte meiosis等向protein dephosphorylation、postsynaptic density等变异。7、体内实验结果表明,Mel-888 N19增殖速度、成瘤能力比亲代更强;Mel-624 N19增殖速度、成瘤能力与亲代相当。8、稳定表达单个VRT1-12、TOP1000片段的黑色素瘤细胞系可通过压力筛选获得耐药表型。细胞呈神经纤维细胞样伸长,胞浆相对减少。9、结晶紫、Hochest 33258染色结果表明,稳定表达单个VRT1-12、TOP1000片段的黑色素瘤细胞系获得耐药表型后可短期和长期存活。结论:我们成功构建出无基因组偏倚的短链非编码文库N19,并完成了对BRAF突变型黑色素瘤获得性维罗非尼靶向疗法耐药的前瞻性探索。于体外成功模拟了临床耐药的发生进程,阐明了获得性耐药与基因组SNV以及mi RNA调控网络之间潜在的作用机理。N19文库相关结构或碱基特征序列可能作为黑色素瘤获得性耐药的早期监测指标。