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前言
NO是一种重要的血压调节因子,它由左旋精氨酸在三种一氧化氮合酶(NOS)催化下合成。NOS包括:神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)。NOS是NO生成的最主要的限速因子。非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是三种NOS的共同内源性抑制剂,它能够竞争性抑制NOS活性进而降低NO生物效应。在体内ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解,90%以上的ADMA通过DDAH分解代谢。ADMA在体内的蓄积可引起血管内皮功能障碍、血管阻力增加、血管结构改变,其水平在高血压、高血脂等疾病中显著升高。DDAH分为两种亚型(DDAH1和DDAH2),DDAH2具有较为广泛的组织表达谱,同时其在某些条件下在调节ADMA代谢中发挥更为重要的作用,因此本课题选择DDAH2作为研究对象。
蛋白质乙酰化是一种生物体内广泛存在的表观遗传学修饰。多种蛋白质可进行乙酰化修饰,它们主要在转录水平调节基因表达。组蛋白乙酰化可中和其电荷,形成较为开放的染色质构象,使转录相关因子更容易与DNA结合,从而增强转录;转录因子的乙酰化主要通过改变蛋白质的转录活性、DNA亲和力、蛋白质稳定性及蛋白间的相互作用等多种特性来调节基因表达,核因子-κB(NF-κB)就是一种受乙酰化调节的转录因子。蛋白质的乙酰化水平主要受两类酶的调节,即组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)。前者将乙酰辅酶A的乙酰基团转移至蛋白质特定赖氨酸残基而引起蛋白质乙酰化,p300就是一种具有HAT活性的转录辅激活因子;HDAC与其作用相反,二者的平衡可使蛋白质维持恰当的乙酰化水平。曲古抑菌素A(TSA)能够特异性抑制HDAC活性,并在转录过程中募集HAT,使组蛋白和转录相关因子乙酰化,常被作为一种乙酰化作用因素。
迄今为止,尚无有关乙酰化对DDAH基因表达调控的报道。课题组前期工作及其他相关研究显示组蛋白及NF-κB乙酰化参与NOS基因表达调控,本研究旨在探讨乙酰化是否亦参与DDAH2基因的表达调节及其机制,从而寻找一种同时调节NOS和ADMA/DDAH系统的途径,则其可能在体内NO合成中发挥重要作用,为探索高血压发生的新的分子机制和寻找新的治疗靶标提供理论依据。
材料与方法
一、实验材料
1、人胚肾细胞系HEK293。
2、Real-timeRT-PCR及Western印迹杂交相关试剂。
3、质粒载体构建与荧光素酶报告基因检测相关试剂。
4、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相关试剂。
二、实验方法
1、Real-timeRT-PCR方法检测TSA刺激及过表达p300对DDAH2mRNA表达水平的影响。
2、Western印迹杂交检测TSA及p300对DDAH2蛋白表达水平的作用。
3、应用软件分析DDAH2启动子结构;构建DDAH2启动子荧光素酶报告基因载体,应用双荧光素酶检测系统分析启动子活性。
4、EMSA方法体外鉴定DDAH2启动子区NF-κB反应元件及TSA对NF-κB与该元件结合力的影响。
5、ChIP实验进一步在体内条件下验证NF-κB与所鉴定元件的结合及TSA对其结合的作用。
6、ChIP方法检测DDAH2启动子NF-κB反应元件区域组蛋白乙酰化水平及TSA对组蛋白乙酰化的影响。
7、应用免疫沉淀方法检测TSA对NF-κBp65及p50亚基乙酰化水平的调节作用。
结果
1、Real-timeRT-PCR结果显示,TSA刺激及过表达野生型p300可显著提高DDAH2mRNA表达水平,而HAT结构域缺失的突变型p300无此作用,同时p300抑制剂可拮抗p300对DDAH2的表达上调作用。
2、TSA可同时上调DDAH2蛋白表达,与其对mRNA水平的作用一致,但p300对DDAH2蛋白表达无明显作用。
3、软件分析发现DDAH2启动子区(-530～+63)存在多个潜在的NF-κB反应元件。结合潜在的NF-κB反应元件,我们构建了两个DDAH2启动子荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶系统分析提示-530～-171区域存在正调控元件,同时TSA刺激可使启动子活性上升。
4、EMSA实验在体外条件下证明了DDAH2启动子-476～-469区为NF-κB反应元件,同时TSA刺激可增强NF-κB与该位点的结合。
5、ChIP实验在体内条件下验证了NF-κBp65与p50亚基与所鉴定元件的结合,并且TSA上调NF-κB与DNA亲和力。
6、ChIP结果显示在基础状态下可检测到DDAH2启动子NF-κB反应元件区域组蛋白H4乙酰化,同时TSA显著上调H4乙酰化水平;但在基础状态及TSA刺激下均未检测到H3乙酰化。
7、免疫沉淀实验在基础状态下观察到了NF-κBp65及p50亚基的乙酰化,并且TSA可上调二者乙酰化水平。
结论
1、DDAH2启动子-476～-469区为NF-κB反应元件。
2、DDAH2启动子NF-κB反应元件区域组蛋白H4乙酰化及NF-κB自身乙酰化可增强其与该区域的结合,这一机制可能通过参与DDAH2转录激活,而在乙酰化上调DDAH2mRNA及蛋白表达水平中发挥一定的作用。