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[目的]动脉粥样硬化(AS)是一种复杂的慢性血管炎症性疾病,炎症反应贯穿病变的始终,主要机制包括脂质聚集和动脉壁的慢性炎症,炎症反应中巨噬细胞的聚集是AS的一个标志。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)可上调基质金属蛋白酶(MMPs)的表达,激活下游多种通路诱导炎症反应。TLR-4/NF-κB信号通路作为一种经典的炎症通路,已有研究发现EMMPRIN可激活TLR4下游NF-κB信号通路,上调炎症反应,加快动脉粥样硬化进程。自噬是维持细胞稳态的溶酶体降解过程,与AS密切相关,一定范围内自噬的激活可减轻炎症反应,降低细胞内脂滴的积累,清除功能失调的线粒体及降低细胞内氧自由基(ROS)水平,抑制细胞凋亡。而过度自噬则导致细胞过度死亡,斑块纤维帽变薄,炎症因子高表达,加剧斑块破裂。AS中TLR4信号通路、EMMPRIN均与自噬相关。TLR4通路的激活可上调自噬,EMMPRIN同样也可上调细胞自噬水平,一定范围内自噬的激活可减缓斑块破裂进程。而TLR-4信号通路是否参与EMMPRIN调节细胞自噬过程尚不清楚。本研究旨在探讨EMMPRIN是否通过TLR4信号通路调节人THP-1巨噬细胞自噬水平。[方法]1.人THP-1单核细胞的培养及诱导分化:将人THP-1单核细胞置于完全培养基中培养于37℃,含95%空气及5%二氧化碳的培养箱中。生长至一定数量后,将细胞数调整为1×10∧6个/ml并移至六孔板中,每孔接种细胞悬液2ml,参照相关文献,将佛波酯调整至终浓度为5ng/ml诱导培养48小时后,用PBS清洗3次,在无血清培养基中继续培养3h,得到的人THP-1巨噬细胞根据不同的分组进行相应处理。2.确定EMMPRIN的刺激浓度及刺激时间:通过CCK8检测不同时间点EMMPRIIN对人THP-1巨噬细胞的毒性,再结合本课题组的前期研究,确定EMMPRIN的最佳刺激浓度及刺激时间。3.实验分组并检测各实验组的相关蛋白表达及自噬小体情况:为更好的阐述EMMPRIN通过TLR4信号通路调节人THP-1巨噬细胞自噬水平,将实验分为以下三组:空白对照组、EMMPRIN刺激组、TAK-242组,分别经Westerin Blot检测TLR-4、NF-κB、LC3、Beclin1、P62蛋白表达水平;免疫荧光检测LC3、Beclin1、P62蛋白的荧光表达情况;电镜寻找自噬小体。[结果]1.人THP-1巨噬细胞模型的成功建立:通过终浓度为5ng/ml的PMA(佛波酯)刺激人THP-1单核细胞48h后,90%的人THP-1单核细胞由悬浮状态变为贴壁生长,形态由圆形变为椭圆形、棘形或长梭形,部分伸出伪足,体积明显增大,表明人THP-1单核细胞已成功分化为巨噬细胞。2.EMMPRIN最佳刺激浓度及最佳刺激时间的确定:结合本课题组的前期研究及CCK-8毒性实验发现,1ng/ml的EMMPRIN刺激人THP-1巨噬细胞6h后,EMMPRIN活性相对较高,且细胞毒性相对较低,故确定EMMPRIN的最佳刺激浓度为1ng/ml,最佳刺激时间为6h。3.EMMPRIN刺激人THP-1巨噬细胞后TLR-4、NF-κB蛋白表达水平明显升高:1ng/ml的EMMPRIN刺激人THP-1巨噬细胞6h后,与空白对照组相比,TLR-4、NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。4.EMMPRIN刺激人THP-1巨噬细胞后LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达降低:1ng/ml的EMMPRIN刺激人THP-1巨噬细胞6h后,Western Blot结果发现:与空白对照组相比,EMMPRIN组的LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05);Beclin1蛋白表达水平虽无统计学意义,但仍较空白对照组高;P62蛋白表达水平降低(P<0.05)。免疫荧光检测发现:与空白对照组相比,EMMPRIN组的LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白荧光表达水平明显升高(P<0.05)。5.抑制TLR4信号通路后,NF-κB蛋白表达水平降低的同时,LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平也降低,P62蛋白表达水平升高:5umol/L的TAK-242刺激人THP-1巨噬细胞4h后,PBS清洗3次,再加1ng/ml的EMMPRIN刺激6h,Western Blot结果发现:与EMMPRIN组相比,TAK-242组的TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.01)的同时,LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白水平也降低(P<0.05),P62蛋白表达水平升高(P<0.01)。免疫荧光检测发现:与EMMPRIN组相比,TAK-242组的LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白荧光表达水平降低(P<0.05),P62蛋白荧光表达水平虽无统计学意义,但仍较EMMPRIN组的高。6.EMMPRIN刺激后发现较多自噬小体:5umol/L的TAK-242刺激人THP-1巨噬细胞4h后,PBS清洗3次,再加1ng/ml的EMMPRIN刺激6h后行电镜检测发现:与EMMPRIN组及空白对照组相比,TAK-242组未发现自噬小体;与空白对照组相比,EMMPRIN组可发现较多自噬小体。[结论]1.EMMPRIN能促进人THP-1巨噬细胞中TLR-4、NF-κB蛋白的表达水平,说明EMMPRIN可能正向调节TLR4信号通路,促进炎症反应。2.EMMPRIN能促进人THP-1巨噬细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表达,下调P62蛋白的表达,且发现较多自噬小体,说明EMMPRIN可能导致巨噬细胞过度自噬。3.EMMPRIN激活TLR-4/NF-κB信号通路后自噬标志LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平明显上调,P62蛋白表达降低,且可找到自噬小体;抑制TLR4信号通路,TLR-4、NF-κB蛋白下调的同时,自噬标志LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达也下调,而P62蛋白表达升高,且未发现自噬小体,说明EMMPRIN可能通过TLR4信号通路调节巨噬细胞过度自噬,有望为临床治疗靶向提供新的实验基础。