蛋氨酸（Methionine,Met）不仅是蛋白质合成的底物之一,而且还通过代谢参与了其它众多的生物学事件。Met的代谢途径主要包括转甲基代谢、氨丙基转移、转硫基代谢与再甲基代谢。Met的转甲基代谢产物S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）可以为DNA、RNA以及组蛋白的甲基化修饰提供甲基供体;转硫基代谢产物半胱氨酸（Cysteine,Cys）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、牛磺酸（Taurine,Tau）可发挥抗氧化功能;氨丙基转移代谢产物中精胺、亚精胺和腐胺对细胞的增殖有重要的调控作用,此过程代谢生成的5-甲硫腺苷（5-methylthioadenosine,MTA）则可以作为Met再合成的底物;而再甲基代谢则可以利用中间代谢产物同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）重新合成Met,从而调节细胞内Met含量的相对平衡。Met是猪重要的限制性氨基酸,在饲料中常用的Met补充剂主要有DL-蛋氨酸（DL-Methionine,DL-Met）、DL-蛋氨酸羟基类似物（DL-2-hydroxy-4-（methylthio）butyric acid,DL-HMTBA）以及DL-蛋氨酸二肽（DL-Methionine-Mehthionine,DL-MM）。但不同形式的Met源在组织中转化为L-Met,并且代谢生成代谢产物的能力是否存在差异尚不清楚。因此,揭示不同形式Met源在猪体内不同组织的代谢差异,阐明代谢差异与不同形式Met源影响组织功能的关系,对认识不同形式Met源的差异性营养机理具有重要意义,也对生产中选择适宜形式的Met源具有重要的指导价值。本研究建立了同时检测猪不同细胞中Met代谢产物与辅助因子含量的LC-MS/MS方法;测定了不同形式Met源在猪的多种细胞系中代谢产物的变化及其代谢规律;进一步揭示了在猪肠上皮细胞（intestinal porcine epithelial cell line,IPEC-J2）、髋动脉内皮细胞（pig iliac artery endothelial cell line,PIEC）和滋养层细胞（porcine trophectoderm cell line,pTr2）中不同形式Met源对细胞功能的影响;并从甲基化修饰的角度,探索了不同形式Met源代谢差异及对猪细胞功能和mRNA的m⁶A修饰水平的影响。主要研究内容和结果如下:1. 同时检测Met代谢产物与辅助因子的LC-MS/MS方法的建立本研究以IPEC-J2和PIEC细胞为材料,建立了能同时检测Met代谢产物与辅助因子的LC-MS/MS方法。通过优化流动相与还原剂,确定以10mmol/L乙酸铵为流动相A,甲醇与乙腈4:1混合溶液为流动相B,TCEP为还原剂。结果表明,各分析物的定量限为0.02-0.91 ng/10⁶个细胞,回收率范围为74.1%-117.4%,准确度为93.5%-123.4%。除MTA与维生素B12（vitamin B12,VB12）以外,其他物质的日内与日间检测值的RSD均小于15%,除Hcy外,各物质的基质效应均小于20%,以上结果表明该检测方法可靠。2. 不同Met源在猪多种细胞系中的代谢特点利用建立的LC-MS/MS检测方法,检测了分别以L-Met、DL-Met、DL-HMTBA与DL-MM作为Met源时,猪的IPEC-J2细胞、肾脏细胞（pig kidney cell line,PK-15）、PIEC和pTr2细胞系,以及原代肝脏细胞中Met的代谢产物与辅助因子的含量,以揭示其代谢特点。主要结果如下:（1）以DL-HMTBA和DL-MM作为Met源时,IPEC-J2和pTr2细胞中Met的含量显著低于其它Met源组（P<0.01）;而在猪肝脏细胞、PIEC和PK-15细胞中,各组的Met含量差异不显著。通过应用Transwell模型,并测定下层腔室中Met源的含量发现,大量DL-HMTBA逃逸了IPEC-J2细胞的代谢,以DL-HMTBA的形式转运出IPEC-J2细胞;而部分DL-MM则以二肽与游离Met形式转运出IPEC-J2细胞,致使DL-HMTBA和DL-MM向胞外提供的Met源高于其他Met源组。（2）对于转甲基代谢而言,以DL-HMTBA为Met源时,5种细胞中MAT2A的mRNA水平显著提高,但其产物SAM在IPEC-J2和pTr2细胞中仍显著低于其它组（P<0.01）;而SAM转甲基代谢后的产物SAH则仅在IPEC-J2中仍较其它Met源低,在其它细胞中均显著高于其他Met源组;除肝脏细胞外,以DL-HMTBA为Met源时,SAM/SAH比值显著低于其它Met源组（P<0.01）。DL-MM对SAM和SAH的影响与DL-HMTBA类似,但影响较小。以上结果表明,DL-HMTBA促进了Met的转甲基代谢,而这种改变可能与代谢酶MAT2A的表达量提高有关。（3）对于转硫代谢而言,作为转硫代谢的底物,在IPEC-J2细胞中,DL-HMTBA处理组胞内Hcy含量显著低于其他Met源,而在肝脏细胞和PK-15细胞中显著高于其他Met源处理组（P<0.01）,在PIEC细胞中则是无显著性差异。在5种细胞中,DL-HMTBA均提高了胞内转硫代谢产物Cys或/和GSH或/和H₂S的含量。该代谢差异可能与DL-HMTBA提高胞内CBS或/和CTH的mRNA水平有关（P<0.01）。表明DL-HMTBA可能通过上调CBS或/和CTH表达,促进了Met的转硫代谢。（4）对于再甲基代谢和氨丙基转移而言,在IPEC-J2、猪肝脏细胞、PK-15与pTr2细胞中,DL-HMTBA提高了5-MTHF或/和MTA的水平,并且显著提高了IPEC-J2、猪肝脏细胞与pTr2细胞中MTHFR或/和MTR的mRNA水平（P<0.01）,意味着DL-HMTBA可以促进Met再甲基代谢或/和再合成。因此,DL-HMTBA显著提高了Met的转甲基、转硫和再甲基代谢,并且这种代谢上的差异可能与DL-HMTBA提高了相关代谢酶的表达有关。DL-HMTBA与其它Met源的代谢差异主要表现在IPEC-J2和pTr2细胞中,其次是PIEC细胞。3. 不同比例L-Met/DL-HMTBA对IPEC-J2、PIEC和pTr2细胞Met代谢的影响配制L-Met与DL-HMTBA含量比值为100%:0%、85%:15%、70%:30%、40%:60%以及0%:100%的培养基,研究了不同比例DL-HMTBA作为Met源时,IPEC-J2、PIEC、pTr2细胞中的Met代谢变化,主要结果如下:（1）对于转甲基代谢而言,与只含有L-Met相比,当L-Met与DL-HMTBA的比值≤85%:15%时,各种细胞内SAM含量与SAM/SAH比值均显著降低;但仅在IPEC-J2细胞中MAT2A的mRNA水平显著高于仅含有L-Met的处理组（P<0.01）,表明DL-HMTBA对Met转甲基代谢产物的影响较代谢酶的影响更敏感。（2）对于转硫代谢而言,与仅含有L-Met相比,当L-Met与DL-HMTBA的比值≤85%:15%时,各种细胞中转硫代谢产物Cys、GSH或/和H₂S的含量显著提高;当进一步提高DL-HMTBA,使L-Met与DL-HMTBA的比值≤40%:60%（IPEC-J2）或只存在DL-HMTBA时（PIEC和pTr2）,才会显著提高代谢酶CBS和CTH的mRNA水平（P<0.01）。以上结果说明,DL-HMTBA对Met转硫代谢产物的影响较代谢酶的影响更敏感。（3）对于再甲基代谢而言,当L-Met与DL-HMTBA的比值≤40%:60%时,仅IPEC-J2细胞内Met显著低于而5-MTHF显著高于仅含有L-Met的处理组;而仅存在DL-HMTBA时,才会显著提高胞内MTHFR与MTR的mRNA水平（P<0.01）。这说明,只有当胞内蛋氨酸显著缺乏时,DL-HMTBA才会显著提高蛋氨酸再甲基代谢的相关代谢酶与代谢产物的含量。4. 不同比例L-Met与DL-HMTBA对PIEC、pTr2与IPEC-J2细胞功能的影响与可能机制（1）与仅含有L-Met相比,当L-Met与DL-HMTBA的比值≤40%:60%时,会显著影响细胞的功能,显著降低PIEC细胞血管生成的管腔数、节点数以及分支长度;显著提高pTr2细胞转运到胞外的亮氨酸、异亮氨酸与赖氨酸的含量;显著抑制了H₂O₂处理后IPEC-J2单层细胞通透性的增加（P<0.05）。（2）胞内SAM含量和SAM/SAH比值分别与PIEC细胞血管生成及VEGF164的mRNA水平呈显著正相关;与pTr2细胞氨基酸转运体CAT1和SNAT2的mRNA水平呈显著负相关;与IPEC-J2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin和Occludin的mRNA水平呈显著负相关（P<0.05）。这说明,DL-HMTBA影响细胞功能可能与胞内SAM含量和SAM/SAH值的改变以及与相应功能有关的关键基因mRNA水平的变化有关。（3）在IPEC-J2细胞中,当L-Met与DL-HMTBA的比值≤70%:30%时,RNA甲基转移酶METTL3、去甲基化酶FTO、识别蛋白YTHDF2的mRNA水平显著高于仅含有L-Met的处理组（P<0.01）;DL-HMTBA显著降低细胞中MAT2A与ZO-1的mRNA的m⁶A修饰,并显著提高MAT2A与ZO-1的mRNA稳定性（P<0.05）。这说明,DL-HMTBA提高IPEC-J2细胞紧密连接蛋白的表达,可能与降低胞内mRNA的m⁶A修饰有关。综上所述,本研究的主要结论是:（1）DL-HMTBA具有与其他来源的Met不同的代谢特征,在IPEC-J2和pTr2细胞中显著提高了转甲基、转硫和再甲基代谢水平,该差异的产生可能与DL-HMTBA提高了相关代谢酶的表达有关。（2）在PIEC、pTr2与IPEC-J2细胞中,当DL-HMTBA占总Met源超过15%时,会显著影响转甲基和转硫代谢产物的含量,降低SAM/SAH比值;而进一步提高到30%和60%以上时,会显著影响细胞中的基因表达。在IPEC-J2细胞中,DL-HMTBA降低紧密连接蛋白ZO-1的mRNA的m⁶A修饰程度,提高其mRNA的稳定性,从而提高ZO-1的mRNA水平与蛋白水平,进而提高细胞屏障功能。