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背景肾纤维化是高血压、糖尿病等多种疾病所致慢性肾脏病进展至终末期肾病的共同病理过程。现代药理学研究结果发现,地黄具有降血糖、抗炎、调节免疫、治疗心脑血管疾病的作用,能够治疗多种诱发慢性肾脏病的基础疾病。现代药理研究发现,梓醇具有抗炎、降血糖的作用,能够延缓糖尿病导致的心肌纤维化和肾纤维化。课题组推测:地黄通过调控Wnt/β-catenin通路,阻抑EMT,从而延缓肾纤维化进程,梓醇可能是其药效学物质基础。本研究得到重庆市中医院药剂科和肾病科支持,得到国家自然科学基金项目（81603611）基金资助。目的观察生地黄延缓肾纤维化的效果,探讨其作用机制是否与调控Wnt/β-catenin信号通路相关,验证其主要药效物质基础是否是梓醇。方法1试验用生地黄饮片的质量鉴定照2015年版《中国药典》地黄项下方法对试验用生地黄饮片进行鉴定和含量测定。2单侧输尿管梗阻大鼠模型复制及分组给药雄性SD大鼠50只,分为造模组40只（结扎左侧输尿管）,假手术组10只（不结扎）。模型成功的标准为大鼠梗阻侧肾脏组织明显肿大;HE染色结果中肾小管囊性扩张明显,有较多炎性细胞浸润;Masson染色结果中胶原纤维蓝染明显增多。将造模成功的大鼠随机分为模型组、生地黄3.2g·kg-1组、1.6g·kg-1组、0.8g·kg-1组,各10只。生地黄组灌胃给予水煎液每天1次,连续14天。3生地黄水提液延缓单侧输尿管梗阻大鼠模型肾纤维化机制研究于末次灌胃结束1h后,麻醉取血,采用酶联免疫法测定血清中肌酐、尿素氮。取肾脏石蜡切片,HE染色观察肾脏组织病理改变,Masson染色观察肾小管间质纤维化,免疫组化法和免疫印迹法检测肾纤维化标志蛋白α-SMA、Vimentin、Collagen I、E-cadherin及Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt5a、GSK-3β、β-catenin的表达。取肾组织匀浆,采用免疫印迹法观察上述蛋白的表达。4人肾小管上皮细胞转化模型及分组以10ng·ml-11 TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转化,设正常组、模型组、梓醇10μg·ml-1组、50μg·ml-1组、100μg·ml-1组,给药后共培养24h。5梓醇对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转化模型的作用机制研究显微镜下观察各组细胞形态变化,免疫荧光法观察细胞中转化标志蛋白α-SMA的表达,收集细胞,采用免疫印迹法检测转化标志蛋白Vimentin、α-SMA及Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt5a、GSK-3β、β-catenin的表达。结果1试验用生地黄饮片梓醇薄层色谱鉴定和含量测定结果本试验所用生地黄饮片的供试品溶液与梓醇对照品在相同位置显棕色斑点,HPLC测定梓醇含量为1.19%,符合2015年版《中国药典》中生地黄质量规定。2复制单侧输尿管梗阻大鼠模型成功率及组间均衡性检验模型组大鼠梗阻侧肾脏大于假手术组,HE和Masson染色结果均显示模型组梗阻侧肾脏发生肾小管间质纤维化,提示造模成功,成模率100%。3生地黄水提液延缓单侧输尿管梗阻大鼠模型肾纤维化进程（1）与假手术组相比,模型组大鼠结扎侧肾脏组织的皮质、髓质变薄;肾小管囊性扩张,基底膜增厚,肾小管上皮细胞扁平、脱落、肿胀、空泡;肾小球玻璃样变、球囊粘连、萎缩、间质增宽,炎症细胞浸润;肾髓质间质纤维化、炎症细胞浸润、细胞增殖及管型比皮质更明显。与模型组相比,生地黄3.2g·kg-1、1.6g·kg-1、0.8g·kg-1组大鼠结扎侧肾脏组织中上述病理变化明显改善。（2）与假手术相比,模型组大鼠结扎侧肾脏组织中间质胶原纤维形成明显,蓝染增多;与模型组相比,生地黄3.2g·kg-1、1.6g·kg-1、0.8g·kg-1组大鼠结扎侧肾脏组织中间质胶原纤维形成减少,蓝染减少。（3）与假手术相比,模型组大鼠肾组织中α-SMA、Vimentin、Collagen I的表达显著增多,E-cadherin的表达显著减少（均P<0.01）;与模型组相比,生地黄3.2g·kg-1、1.6g·kg-1、0.8g·kg-1组大鼠肾组织中α-SMA、Vimentin、Collagen I的表达减少,E-cadherin的表达显著增加（均P<0.01）。（4）与假手术组相比,模型组显著升高Collagen I、Vimentin、α-SMA的表达（均P<0.01）;与模型组相比,生地黄各剂量组能显著降低Collagen I、Vimentin、α-SMA的表达（均P<0.01）。4生地黄水提液通过调控Wnt/β-catenin信号通路延缓单侧输尿管梗阻大鼠模型肾纤维进程（1）与假手术相比,模型组大鼠肾组织中Wnt5a、β-catenin表达增多（均P<0.01）;与模型组相比,生地黄3.2g·kg-1、1.6g·kg-1、0.8g·kg-1组大鼠肾组织中Wnt5a、β-catenin表达显著减少（均P<0.01）。（2）与假手术组相比,模型组显著升高Wnt5a、GSK-3β、β-catenin的表达（均P<0.01）;与模型组相比,生地黄3.2g·kg-1、1.6g·kg-1、0.8g·kg-1组Wnt5a、GSK-3β、β-catenin蛋白表达显著降低（均P<0.01）。5梓醇抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转化（1）与对照组比较,模型组人肾小管上皮细胞细胞分化为长梭形;与模型组比较,梓醇10μg·ml-1组、50μg·ml-1组、100μg·ml-1组人肾小管上皮细胞分化均有抑制,维持铺路石状;（2）与对照组比较,模型组纤维化标志蛋白α-SMA较正常组表达显著升高;与模型组比较,梓醇10μg·ml-1组、50μg·ml-1组、100μg·ml-1组α-SMA表达显著降低（均P<0.01）。（3）与正常组相比,模型组Vimentin、α-SMA的表达显著升高（均P<0.01）;与模型组相比,梓醇10μg·ml-1组、50μg·ml-1组、100μg·ml-1组Vimentin、α-SMA的表达均显著降低（均P<0.01）。6梓醇通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预人肾小管上皮细胞细胞转化与正常组相比,模型组Wnt5a、GSK-3β、β-catenin的表达显著升高（P<0.01）;与模型组相比,梓醇10μg·ml-1组、50μg·ml-1组、100μg·ml-1组Wnt5a、GSK-3β、β-catenin的表达均显著降低（P<0.01）。结论1生地黄水提液延缓单侧输尿管梗阻大鼠模型肾纤维化进程,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。2梓醇是生地黄阻抑肾小管上皮间质转化而延缓肾纤维化的主要药效物质。