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紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是从红豆杉属(Taxusspp.)植物中分离得到的一类新型的具有微管抑制活性的天然二萜类抗肿瘤药物,其作用机制独特,对癌症的临床适应范围较广,被认为是抗肿瘤药物研究领域最重大的发现。目前,商品化的紫杉醇及其重要半合成前体10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DeacetylbaccatinⅢ,10-DABⅢ)主要都是从红豆杉属植物材料中提取,这些物质在植物中的含量都较低。自从太平洋紫杉(短叶红豆杉T.brevifolia)的枝条中发现一株能产生紫杉醇的内生真菌以来,从红豆杉植株不同生理学部位中发现产紫杉烷类物质内生真菌的研究极为迅速,国内外相关产紫杉醇内生真菌的研究报道较多,但仍然缺乏稳定和高产的适用于工业化发酵的菌株。这些问题的解决就需要分离更高效的内生真菌菌株,改善分析和检测内生真菌发酵液中紫杉醇及其类似物含量的方法,优化发酵条件,并进一步探寻内生真菌发酵液中紫杉醇及其类似物的分离纯化工艺。本论文以从自然界中获得高产紫杉醇菌株为目的,对不同生境下太行红豆杉(T.chinesis)的根、茎和叶不同部位来源的内生真菌进行产紫杉醇活力筛选。从红豆杉三个部位中共分离内生真菌186株,根、茎和叶分别为93、67和26株;其中野生型红豆杉内生真菌110株,仿野生型红豆杉内生真菌76株。从分离内生真菌的数量和分离效率看野生型红豆杉根部来源的内生真菌更为丰富。根、茎和叶来源的产紫杉醇菌株发酵液中紫杉醇的平均含量分别为248.57、149.09和104.94μg/L;其中最高产一株的含量为622.75μg/L。进一步对产紫杉醇内生真菌发酵液中紫杉醇的定性与定量检测方法进行了研究。采用C18固相萃取柱(SPE)对紫杉醇进行吸附,用不同浓度的甲醇-乙酸铵和甲醇分别作为洗脱剂,之后用高效液相色谱(HPLC)进行分析。研究结果发现,流动相为甲醇:水:乙腈(V/V/V)=20:45:35,流速和检测波长分别为0.70m L/min和227nm的HPLC分析条件最佳;而洗脱剂为80%甲醇时洗脱能力和效果较好,紫杉醇的回收率可达到87.6%。因此,本研究建立了快速高效低耗的SPE-HPLC对内生真菌发酵液中紫杉醇的定性与定量分析方法。论文对产紫杉醇内生真菌发酵液中紫杉醇的纯化工艺进行了初步研究,采用非极性D4020型大孔树脂对产紫杉醇内生真菌发酵液进行吸附和解吸附测试,结果发现D4020型树脂对紫杉醇有较好的吸附和分离效果。优化工艺条件为:室温下,样品溶于体积分数50%甲醇-水溶液,上柱液流量为1.5 m L/min,体积分数80%乙醇-水溶液以流量0.5m L/min洗脱,洗脱剂用量为7倍量树脂体积,回收率可达90%。本论文还对南方红豆杉(T.wallichiana var.mairei)中产10-DABⅢ内生真菌进行了筛选。从南方红豆杉根皮部位分离得到了内生真菌102株,通过HPLC和LC-MS分析,发现了一株木霉属内生真菌Trichoderma sp.IRB54能够产生10-DABⅢ,其在PDB培养基中的产量为187.56μg/L。对IRB54菌株发酵液中的该色谱峰进行了分离纯化,发现该色谱峰与10-DABⅢ标准品具有相同的1H NMR谱图数据,进一步证实IRB54具有产生10-DABⅢ的能力,为10-DABⅢ的来源提供了新的参考。论文又对内生真菌发酵液中10-DABⅢ的快速定性与定量分析方法进行了研究。采用薄层色谱法(TLC)不同比例的三种展开系统:丙酮-石油醚;正己烷-氯仿-乙酸乙酯-甲醇-三乙胺和环己烷-乙酸乙酯,研究其对10-DABⅢ展开效果的影响,再联合HPLC分析进行检测验证。结果发现,以丙酮:石油醚=4:1作为展开剂,乙醇:浓硫酸=9:1为显色剂的检测结果最佳,最小检测限为0.3μg。本研究建立了TLC-HPLC快速定性与定量分析内生真菌发酵液中10-DABⅢ的方法。论文还比较了红豆杉枝条、红豆杉愈伤组织、产10-DABⅢ菌株Trichoderma sp.IRB54单独发酵,红豆杉愈伤组织和红豆杉枝条分别与Trichoderma sp.IRB54耦合发酵5种方法对10-DABⅢ产量的影响,结果发现5种方法获得10-DABⅢ浓度分别为274.6、154.3、189.4、887.5和684.7μg/m L,其中红豆杉枝条和Trichoderma sp.IRB54耦合发酵浓度最高达887.5μg/m L,为产10-DABⅢ内生真菌的开发和利用奠定了基础。本论文对紫杉醇的发现和来源,以及产紫杉醇内生真菌的研究进展进行了文献综述。进一步对内生真菌中发现的萜类次生代谢产物进行了综述,一共总结了274个内生真菌来源的萜类化合物,其中单萜类化合物7个(Monoterpenoids,化合物1-7),倍半萜类化合物69个(Sesquiterpenoids,化合物8-76),二萜化合物38个(Diterpenoids,化合物77-114),杂萜化合物160个(Meroterpenoids,化合物115-274),并对这些萜类化合物的生物活性进行了归纳总结,为后续内生真菌中萜类化合物的研究提供了参考价值。