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尾侧同源盒转录因子(Caudal Homeobox, CDX)是一类在肠道细胞增殖、分化和发育等生理过程中发挥重要作用的转录因子。CDX家族基因特异性表达于肠道细胞，而在胃不表达。病理情况下，CDX1被认为在胃癌的癌前病变—胃粘膜肠上皮化生的诱导和维持中发挥了重要作用。研究表明，胃粘膜不表达CDX1，而在胃粘膜肠上皮化生组织中则高表达CDX1；过表达CDX1的转基因小鼠胃粘膜也会出现广泛的肠化生。CDX1的表达缺失被认为同肿瘤的发生发展尤其是结肠癌的发生和增殖密切相关。不少研究证实结肠癌细胞系和临床标本中CDX1表达出现显著下调；体外实验表明在结肠癌细胞系中过表达CDX1可发现肿瘤细胞增殖受到显著抑制。另外一些在胃癌中的研究发现，同癌旁的肠化生组织相比，胃癌的临床标本中CDX1表达也出现了不同程度的降低。这提示CDX1在胃癌中可能同样具有抑制肿瘤发生发展的作用。然而CDX1在胃癌中的功能及其表达下调的机制尚不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，通过碱基配对原则以其种子区结合靶基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)非编码区或编码区，导致mRNA发生降解和（或）翻译抑制，最终造成靶基因蛋白表达下调，从而在转录后水平抑制靶基因的表达。miRNA在包括胃癌在内的多种胃肠道恶性肿瘤中参与了大量抑癌或致癌基因的负性调控，从而扮演促进或者抑制肿瘤发生发展的角色。那么CDX1的表达下调是否同miRNA的表达紊乱有关？CDX1影响胃癌发生发展的功能是否受到miRNA的调控呢？为探讨转录因子CDX1在胃癌发生发展中发挥的重要作用，揭示其表达下调同胃癌细胞中表达紊乱的miRNA的关系，初步阐述miRNA-CDX1参与调控胃癌恶性表型的分子转导机制，我们对正常胃组织、癌旁肠化生组织和胃癌组织进行了组织芯片免疫组化染色发现，同癌旁组织相比，胃癌中CDX1表达明显下调；进而我们建立了CDX1功能获得细胞模型，针对细胞增殖表型探索了CDX1对胃癌增殖的影响，发现CDX1显著抑制胃癌细胞体外增殖；随后我们通过生物信息学预测发现，miR-296-5p在CDX1的3’非编码区(3’-UTR)具有潜在结合位点，而且细胞系中miR-296-5p的表达同CDX1的蛋白水平呈负相关关系：那么，miR-296-5p是否参与了胃癌细胞中CDX1的负性调控？miR-296-5p-CDX1又是通过何种途径调控胃癌的恶性增殖的？这些问题将是本项研究的重点。【目的】1、明确CDX1在胃癌中的表达及其影响胃癌增殖的功能；2、筛选CDX1上游miRNA(即miR-296-5p)并在胃癌细胞系和组织中验证二者表达的相关性；3、研究miR-296-5p调控CDX1的机制；4、研究miR-296-5p通过CDX1调控胃癌增殖的功能；5、探讨miR-296-5p-CDX1轴调控胃癌增殖的信号转导通路；【方法】1、采用免疫组化在正常胃粘膜、癌旁肠化生组织和胃癌组织芯片中检测CDX1的表达；2、构建CDX1过表达慢病毒载体，转染胃癌细胞建立CDX1过表达稳转细胞系，使用体外检测XTT测定细胞的增殖水平，使用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡水平变化；3、联合多个miRNA靶分子数据库筛选在CDX1存在潜在靶点的miRNA(miR-296-5p)；4、利用qRT-PCR和Western Blot等验证miR-296-5p同CDX1在临床组织标本和胃癌细胞系中表达的相关关系；5、使用荧光素酶报告基因实验和Western Blot验证miR-296-5p对CDX1的调控作用；6、通过miR-296-5p的类似物和抑制物转染细胞，进而采用XTT、细胞周期和凋亡分析检测miR-296-5p对胃癌增殖的影响；7、构建含有和不含有CDX1UTR的载体，分别转染胃癌细胞，并共转染miR-296-5p的类似物，通过Western Blot和功能试验研究miR-296-5p是否通过CDX1调控胃癌增殖；8、通过Western Blot检测肿瘤中重要分子通路蛋白的活化水平，筛选miR-296-5p-CDX1轴调控的信号转导通路，并采用蛋白磷酸酶抑制剂和功能试验对所筛选的分子通路进行验证。【结果】1、 CDX1在胃癌组织中表达下降并抑制胃癌细胞增殖我们利用免疫组化方法在包含30组正常胃组织、癌旁肠化生组织和胃癌组织的组织芯片中检测了CDX1的表达水平。发现正常胃组织几乎不表达CDX1，在肠化生组织中CDX1呈表达弱阳性至强阳性，而在胃癌组织中CDX1的表达则出现明显降低或缺失，统计分析发现，CDX1在胃癌中的表达显著低于癌旁肠化生组织的表达。随后我们对CDX1调控胃癌增殖的功能进行了研究。我们建立了CDX1的慢病毒过表达载体并转染胃癌细胞AGS，通过XTT细胞增殖功能实验发现，过表达CDX1的AGS细胞同对照组相比增殖速度明显减缓。我们接着对对照组和过表达CDX1细胞进行流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率，结果发现过表达CDX1的AGS细胞在G0/G1期比例增加，凋亡率也明显上升。上述结果表明，CDX1在胃癌中表达降低并有抑制胃癌增殖的功能。2、 miR-296-5p同CDX1在胃癌组织和细胞中表达负相关我们随后采用生物信息学预测方法筛选了在CDX13’-UTR具有潜在结合靶点的miRNA。通过联合Targetscan和MicroCosm两个独立的miRNA的靶分子数据库，我们筛选得到了11个可能负性调控CDX1的miRNA。其中miR-296-5p是唯一被报道过具有促进肿瘤多种恶性表型的miRNA.我们随后在多种胃癌细胞系中采用qRT-PCR和Western Blot方法分别检测miR-296-5p和CDX1的表达水平，发现在MKN28、SGC7901和BGC823细胞中CDX1的表达相对较高，对应的miR-296-5p表达相对较低；而在AGS、GC9811和MKN45细胞中CDX1表达则相对较低，对应miR-296-5p表达相对较高。我们随后收集16例胃癌组织和癌旁肠化生组织标本并检测了胃癌和癌旁组织中miR-296-5p和CDX1的表达并统计其相关关系。结果表明表明miR-296-5p同CDX1在胃癌组织中表达负相关。3、 miR-296-5p通过结合CDX1的3’-UTR抑制CDX1的表达我们进一步采用荧光素酶报告基因实验证实，miR-296-5p可能通过同时结合其在CDX13’-UTR的两个结合靶点，从而影响CDX1的表达。此外，我们在胃癌细胞中转染miR-296-5p的类似物和抑制物，并采用qRT-PCR和Western Blot检测CDX1的mRNA和蛋白表达水平，结果表明miR-296-5p在转录后水平调控CDX1的蛋白表达，而不影响其mRNA的转录。4、 miR-296-5p通过抑制CDX1促进胃癌细胞增殖我们随后采用miR-296-5p的类似物mimics和抑制物inhibitor转染胃癌细胞建立了功能缺失和获得模型。XTT检测细胞增殖速度发现抑制miR-296-5p的表达后，AGS细胞增殖显著减慢，而且随着miR-296-5p inhibitor浓度的增加，其生长速度降低更加明显；与之相反，过表达miR-296-5p的MKN28则生长速度显著增加，且随着mimics的浓度增加其生长更快。进一步的流式细胞周期和凋亡分析表明，抑制miR-296-5p的表达后AGS细胞出现明显的G0/G1期周期阻滞，细胞S期降低，且凋亡率明显上升；相反上调miR-296-5p的表达后MKN28的表达后细胞G0/G1期比例明显降低，细胞周期S期则明显上升，并且凋亡率明显下降。这些结果表明miR-296-5p通过调控细胞周期和细胞凋亡维持胃癌细胞增殖。为研究miR-296-5p是否通过调控CDX1影响胃癌细胞增殖，我们构建了含有或不含有CDX13’-UTR序列的CDX1表达载体。将上述载体和对照载体经慢病毒转染AGS细胞后，我们共转染了miR-296-5p的类似物，发现在转染含有CDX13’-UTR载体的AGS细胞中，miR-296-5p能够抑制CDX1蛋白表达；而在转染无3’-UTR载体的细胞中则无该现象发现。随后的功能实验表明，在转染含有3’-UTR的AGS细胞中miR-296-5p可以逆转CDX1导致的细胞增殖抑制，而且消除CDX1导致的细胞周期阻滞和凋亡率增加的现象；相比之下，转染无3’-UTR的CDX1表达载体中，miR-296-5p则不能逆转CDX1对细胞周期和凋亡的影响。上述结果表明，miR-296-5p通过结合CDX1的3’-UTR下调CDX1表达，进而发挥维持和促进胃癌细胞增殖的功能。5、 miR-296-5p通过miR-296-5p-CDX1-ERK轴调控胃癌增殖研究显示，包括MAPK/ERK、PI3K/AKT、NFkB在内的多条维持细胞生存的信号转导通路参与了胃癌发生发展的分子调控。为研究miR-296-5p-CDX1调控胃癌增殖的下游信号转导通路，我们采用Western Blot检测了几个重要的维持细胞生存信号转导通路中关键分子的表达和活化水平。结果显示转染miR-296-5p inhibitor后，AGS细胞ERK1/2的磷酸化蛋白水平明显上调，而总蛋白水平无明显变化；此外AKT、NFkB的总蛋白和磷酸化水平不受miR-296-5p inhibitor转染的影响。我们进一步研究发现，转染CDX1或miR-296-5p inhibitorAGS细胞中均出现ERK及ERK上游分子RAF、MEK的磷酸化水平下降，而总蛋白水平则无显著变化。与此对应，转染CDX1siRNA或miR-296-5p mimics的MKN28细胞中RAF、MEK和ERK1/2的磷酸化蛋白水平明显上升，而总蛋白水平无明显变化。此外，ERK1/2下游的细胞周期相关蛋白Cyclin D1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax也出现了相应的变化，进一步证实miR-296-5p-CDX1-ERK1/2调控细胞周期和凋亡。为研究miR-296-5p和CDX1是否通过ERK1/2调控胃癌增殖，我们采用ERK1/2特异性磷酸化抑制剂PD98059作用于转染miR-296-5p mimics或CDX1siRNA的MKN28细胞。Western Blot结果表明PD98059明显抑制ERK1/2的活化。进一步XTT细胞增殖证实PD98059可以逆转miR-296-5p mimics和CDX1siRNA造成的MKN28细胞增殖的抑制，并且消除后两者导致的细胞周期和凋亡变化。这些结果表明miR-296-5p-CDX1轴通过调控ERK1/2活化水平调控胃癌细胞增殖。【结论】CDX1在胃癌中同癌旁肠化生组织相比表达下降，其上游受到miR-296-5p的负性调控，下游调控ERK1/2的活化进而影响胃癌增殖；因此胃癌中存在miR-296-5p-CDX1-ERK1/2的新的调控机制，通过影响细胞周期和细胞凋亡维持和促进胃癌细胞增殖,这将对于理解肠化生到胃癌的进展和遏制胃癌增殖提供新的思路。