[目的]1.利用恒河猴和SD大鼠探索建立角膜内皮失代偿动物模型,对比分析各自的优缺点和应用前景,为研究角膜内皮失代偿疾病动物模型建立提供新思路。2.研究水通道蛋白AQP-1、AQP-3、AQP-5、Na+-K+-ATP酶和第2个线粒体衍生的半胱天冬酶激活因子/低等电点的IAP直接结合蛋白(Smac/DIABLO)在聚维酮碘诱导的大鼠角膜内皮失代偿动物模型中的表达变化,初步探讨其作用机制。[方法]1.通过超声损伤诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿动物模型,并进行临床和病理观察。2.通过前房灌注0.5%和0.25%浓度的聚维酮碘(PVP-I)诱导建立SD大鼠角膜内皮细胞失代偿动物模型,并进行临床和病理观察。3.对两种不同方法建立角膜内皮失代偿动物模型的优缺点进行比较分析。4.应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blot观察水通道蛋白AQP-1、AQP-3、AQP-5、Na+-K+-ATP 和 Smac/DIABLO 在大鼠角膜内皮失代偿动物模型中的mRNA和蛋白表达变化。[结果]1.改良超声法诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿模型成功率为100.0%。在超声损伤角膜内皮后,角膜改变逐渐出现在内皮层、基质层、前弹力层和基底上皮层,术后4w出现角膜严重混浊,明显的上皮下大泡改变。共聚焦显微镜检查显示超声损伤后早期主要改变是角膜内皮细胞间隙增宽、细胞轻度水肿,基质层出现活化的基质细胞和细胞形态改变,基质厚度增加,术后2周开始出现前弹力层上皮状神经纤维减少,同时伴有基质层和内皮水肿加重,术后3周基底上皮细胞间隙增宽,少量朗格汉斯细胞浸润,基质层和内皮水肿加重,术后4周基底上皮层大量朗格汉斯细胞浸润,前弹力层仅见少量上皮状神经纤维,基质层大量活化的基质细胞,内皮层严重水肿。随着造模时间延长,实验组角膜厚度不断增厚,与术前相比,差异具有统计学意义,造模后不同时间点与对照组相比差异具有统计学意义。造模后4周HE染色几乎看不到角膜内皮层,Descemet’s膜暴露,基质层厚度显著增加;扫描电镜下显示大片的Descemet’s膜裸露,仅有极少数内皮细胞附着,残留的角膜内皮细胞明显水肿。2.0.5%(实验1组)和0.25%(实验2组)PVP-I前房灌注诱导建立SD大鼠角膜内皮功能失代偿模型的成功率均为100.0%,0.5%浓度组在术后14d即出现明显的角膜内皮功能失代偿改变,而0,25%浓度组则在30d才出现明显的角膜内皮功能失代偿改变。术后并发症主要是前房积血和眼球萎缩,5眼(5.0%)眼发生前房积血,包括1组2眼(4.0%)和2组3眼(6.0%)。有4眼(4.0%)发生眼球萎缩,包括1组3眼(6.0%)和2组1眼(2.0%)。总的并发症发生率在实验1组和2组分别为10.0%和8.0%,两组间并发症发生率没有统计学意义(X2=2.7616,p>0.05)。实验1组、2组随着观察时间的延长,角膜厚度出现不断增加的趋势,1组术后14d、30d中央角膜厚度与术前和空白对照组中央角膜厚度相比均有显著性差异(p<0.05);2组在30d时CCT与术前和空白对照组中央角膜厚度相比均有显著性差异(p<0.05)。HE染色显示1组和2组均出现不同程度角膜内皮细胞消失,角膜基质增厚可见丰富血管,胶原纤维组织消失。扫描电镜显示两组不同程度的内皮细胞脱落、水肿,透射电镜显示内皮细胞线粒体嵴内水肿,轴突水肿。实验1组的病理、扫描和透射电镜改变均较2组严重。3.在大鼠角膜内皮失代偿动物模型中,RT-PCR结果显示AQP1 mRNA在造模后出现表达显著变化,呈现先降低后升高趋势,到14d达到峰值,表达量约为正常角膜的4.7倍。AQP3 mRNA和AQP5 mRNA在造模后出现表达显著降低趋势,到7d达到谷值,分别为正常角膜表达量的8%和1%。Na+-K+-ATP酶mRNA在在造模后早期出现下降晚期升高的趋势,7d达到谷值,约为正常角膜的1/4,到30d达到峰值,为正常角膜的1.9倍。Smac/DIABLOmRNA表达出现先下降后升高再下降的趋势,3d达到峰值,约为正常角膜的1.5倍,至30d约下降到正常角膜的1/4。Western-blot结果显示,与正常角膜组织相比,AQP1蛋白出现先升高后下降趋势,造模后7d达到峰值,约为正常角膜的7倍,在造模后30d低于正常角膜组织的AQP1蛋白表达。Na+-K+-ATP酶蛋白表达显著升高,7d达到峰值,在14d开始降至接近正常角膜。Smac/DIABLO蛋白表达造模后不断升高,7d达到峰值,30d仍然显著升高。[结论]1.改良超声法能成功诱导建立恒河猴角膜内皮失代偿模型,共聚焦显微镜对于动态观察恒河猴角膜变化情况是有用的工具。2.0.5%和0.25%PVP-I前房灌注均能成功诱导建立SD大鼠角膜内皮失代偿模型,PVP-I造模存在引发眼球萎缩的可能性,0.5%浓度的PVP-I可以更加快速诱发模型,临床表现也更为典型。3.SD大鼠角膜内皮失代偿发生发展过程中,水通道蛋白在蛋白表达和mRNA表达均发生了显著变化,其中AQP1先降低后显著升高,AQP3和AQP5出现显著下降;AQP1的蛋白表达也出现显著升高然后下降。Na+-K+-ATP酶出现mRNA表达先下降后升高,蛋白表达出现先升高后降低的改变。Smac/DIABLO mRNA表达现先下降后升高再下降,蛋白表达水平则持续升高。4.SD大鼠角膜内皮失代偿模型角膜组织中发生了 AQPs、Na+-K+-ATP酶和Smac/DIABLO的表达显著变化,说明在CED的病理生理过程中,AQPs和Na+-K+-ATP 酶、Smac/DIABLO 起到了重要作用。AQP1 和 Na+-K+-ATP 酶可能是CED病情变化的敏感指标,Smac/DIABLO可能通过线粒体凋亡途径调节角膜组织的细胞凋亡,参与到CED发生发展的的病理生理过程,但具体的作用机制待进一步研究证实。