目的:胃癌是一种严重威胁人体健康的疾病,居全球肿瘤发病率和癌症死亡率的第二位。在我国其发病率居各类肿瘤的首位,每年胃癌死亡人数几乎占全部恶性肿瘤死亡人数的1/4。足叶乙甙(etoposide, VP-16)是现代临床上肿瘤化疗常用药,对多种肿瘤都能起到很好的治疗作用。它属于拓扑异构酶II毒性抑制剂,主要通过稳定Topo II-DNA断裂复合体,而抑制DNA的再连接,造成DNA断裂损伤,最终达到杀伤肿瘤细胞的目的。临床上应用HLFP方案联合VP-16治疗某些不能手术或术后复发的胃癌患者已取得了较好的疗效。但也存在易导致肿瘤细胞耐药等不利影响。因此,深入认识VP-16的作用靶点,有助于减少其耐药性的产生,提高胃癌的治疗效果。SIRT1是具有烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性的sirtuin去乙酰化酶家族中的一员,它与酵母菌SIR2基因同源,具有蛋白去乙酰化活性,参与细胞的代谢、衰老以及肿瘤的发生发展等一系列病理生理过程。E2F家族是一组能够编码转录调节因子的基因,是细胞周期进程的重要调控因子。其中E2F1是细胞周期的正向调控因子,在细胞从G0/ G1期进入S期的进程中发挥着重要作用。同时,E2F1也在细胞增殖和细胞凋亡等方面扮演着重要的角色。目前,关于SIRT1和E2F1在肿瘤细胞凋亡过程中的表达变化情况未见报道。本研究以人胃癌BGC823细胞为研究对象,应用MTT、Hoechst 33258荧光染色、流式细胞术等技术,体外观察化疗药物VP-16对BGC823细胞生长的抑制效应和促凋亡作用以及对细胞周期的影响。同时,应用免疫细胞化学、RT-PCR、Western blot等方法检测VP-16在诱导胃癌细胞凋亡过程中对SIRT1和E2F1基因及蛋白表达情况的影响,来进一步探讨SIRT1、E2F1和胃癌细胞的关系,为增加在肿瘤治疗过程中对VP-16作用靶点的认识提供帮助。方法:1细胞培养1.1细胞复苏人BGC823细胞由液氮取出后,放入37℃的温水中迅速溶解后,加约10倍体积的RPMI 1640培养基混匀,经500~1000 rpm/min离心去除冻存液,并用培养液洗涤一次。其后,将细胞转入培养瓶,加入培养液(含10 %新生牛血清,青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml),置37℃,5 % CO2培养箱培养。1.2细胞传代待细胞长满培养瓶底面后,吸出培养液,加入0.04 %的EDTA,37℃消化8 min。倒掉消化液,加入培养液反复吹打。依据细胞浓度,扩增至2-3个培养瓶,继续培养。2 MTT法检测VP-16对人BGC823细胞的抑制作用2.1 VP-16稀释及浓度选择VP-16以无血清培养基稀释,按照不同的浓度分别加入到培养板中不同的孔内,使药物终浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、40 ug/ml、80 ug/ml、160 ug/ml、320 ug/ml。2. 2 MTT检测细胞抑制率将对数生长期的各组细胞分别以1×105个/mL浓度接种于96孔培养板中,每孔加入200μL。24h后按照分组分别加入经无血清RPMI 1640稀释的VP-16,每组均做6个复孔,其中空白对照组只加培养基,对照组加DMSO。各组细胞分别培养至24小时和48小时,每孔加入20μL 5 g/L MTT。继续培养4 h后,1000 r/min离心10 min,吸去上清液,每孔加入150μL DMSO终止反应,振荡仪振荡10 min。用ELX800型酶标仪在490 nm波长下测吸光值(A值)。根据24小时和48小时的A值绘细胞生长曲线图,并分别计算出24小时和48小时的IC50值。本实验重复6次。3 Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态改变分别收集对数生长期的各组BGC823细胞制成单细胞悬液,将细胞用PBS洗后重悬,加入Hoechst 33258荧光试剂0.5ml,吹打混匀,滴至载玻片上,加盖玻片。置荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。本实验重复3次。4流式细胞术检测各药物浓度组细胞细胞周期和细胞凋亡率的变化检测细胞周期:实验分组同上。将对数生长期的各组BGC823细胞制成单细胞悬液, PBS冲洗2遍后70%酒精固定,用EB进行DNA定量荧光染色30min后进行流式细胞分析。结果用DNA细胞周期分析软件ModFit LT 2.0计算G0/ G1、S、G2/M期分布百分比。本实验重复3次。检测细胞凋亡率:实验分组同上。各组BGC823细胞培养24小时后,取对数生长期各组细胞,用0.25 %的胰蛋白酶消化、收集细胞,PBS洗涤两次,各加入1 mL的PBS重新悬浮细胞并记数制成约1×106个/mL的单细胞悬液0.5 mL,迅速加入4 mL的70 %冷乙醇中充分混匀,4℃下固定24 h, PBS液洗1遍,应用流式细胞仪检测对照组和各药物组BGC823细胞24 h的凋亡率。本实验重复3次。5免疫细胞化学检测SIRT1和E2F1蛋白表达将对数生长期的各组BGC823细胞,接种于预先置有无菌盖片的6孔培养板中,待细胞爬满盖片后,用4%多聚甲醛固定10 min,3%过氧化氢处理10 min。0.3% Triton X-100处理10 min、10%正常羊血清处理15 min;兔抗人SIRT1(或E2F1)一抗4℃温育过夜。用PBS代替一抗作为阴性对照。山羊抗兔生物素标记的二抗37℃温育40 min;过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃温育40min, 0.05% DAB显色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片、显微镜观察照相。本实验重复3次。6 RT-PCR检测SIRT1和E2F1 mRNA的表达根据核苷酸序列,用Premier 5.0软件设计人SIRT1、E2F1和β-actin引物。采用Trizol法提取对照组和各药物浓度组BGC823细胞总RNA,取2μg细胞总RNA逆转录成cDNA(37℃60 min, 95℃5 min)。取2μl逆转录产物进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,然后观察结果、照相,用凝胶图像分析系统分析结果,分别计算各组BGC823细胞中SIRT1和E2F1条带积分光密度与相对应的β-actin条带积分光密度的比值。本实验重复3次。7 Western blotting检测SIRT1和E2F1蛋白的表达水平收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温1.5~2 h→结合一抗4°C过夜→TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)洗3次,5~10min/次→生物素标记的山羊抗兔二抗室温反应1~2h→TBS-T洗3次,5~10min/次→过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃温育40min,0.05% DAB显色、ECL显影、照相并用凝胶图像分析系统测定并计算各蛋白条带的积分光密度同对应的β-actin积分光密度比值。本实验重复3次。8统计学方法实验结果以x±s表示,用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析(One-Way ANOVA),以P<0. 05为有显著性意义。结果:1 MTT法检测VP-16对BGC823细胞生长抑制作用结果显示,VP-16对BGC823细胞生长具有抑制作用,且具有剂量依赖性和时间依赖性,依吸光度值计算各组细胞的增殖率(Table 1);应用IC50计算软件计算药物对BGC823细胞的半数抑制浓度24h为81.30ug/ml, 48 h为64.54ug/ml。根据此数值把细胞分为一个对照组(不加药)和3个实验组,分别加VP-16使最终浓度分别为40ug/ml、81.30ug/ml、120ug/ml。(以下的实验均按此分组。)根据不同药物浓度下的A值,绘制了细胞生长曲线。(Fig.1)2 Hoechst 33258荧光染色检测各组细胞细胞核形态学改变对照组核损伤比率为4.52±0.56 %,40ug/ml VP-16作用组、81.30ug/ml VP-16作用组、120ug/ml VP-16作用组核损伤比例分别为38.34±2.35%, 52.47±3.67%, 68.62±4.22%。随着药物浓度的增加,各组核损伤细胞比率明显升高,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(Fig.2 A,B,C,D; Table 2)3流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布及凋亡率改变各组细胞周期分布结果:对照组、40ug/ml VP-16作用组、81.30ug/ml VP-16作用组、120ug/ml VP-16作用组的G0/G1期细胞比例分别为56.1±3.12%、26.9±2.14%、19.1±2.03%及5.96±1.87%;S期细胞分别为33.2±2.98%、60.4±3.09%、65.9±3.29%、75.8±3.42%;G2/M期细胞分别为10.8±2.17%、12.7±2.28%、15±2.31%和18.2±2.42%。各实验组细胞随着药物浓度的增加,主要表现为S期细胞明显增多,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(Fig.3,Table 3)各组细胞凋亡率结果:对照组细胞2倍体峰前无明显凋亡峰,凋亡比例为0.98±0.09%。各加药组细胞2倍体峰前有明显凋亡峰,40ug/ml VP-16作用组、81.30ug/ml VP-16作用组、120ug/ml VP-16作用组凋亡比例分别为7.21±0.38%,11.13±0.51%和15.46±0.62%,随着药物浓度的增加,各加药组细胞凋亡比例明显升高,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(Fig.4,Table 4)4免疫细胞化学检测SIRT1蛋白和E2F1蛋白的表达SIRT1蛋白免疫阳性染色多位于细胞质内,细胞核内也有少量。对照组细胞的SIRT1蛋白免疫阳性细胞较多,染色较深,呈深黄色。而实验组细胞(81.30ug/ml VP-16作用组)的SIRT1蛋白免疫阳性细胞较少,染色较浅,呈浅黄色。结果显示,实验组比对照组细胞的SIRT1蛋白表达减少;(Fig.5A,B)E2F1蛋白免疫阳性染色多位于细胞核内。对照组细胞的E2F1蛋白免疫阳性细胞较少,染色较浅,呈浅黄色。而实验组细胞(81.30ug/ml VP-16作用组)的E2F1蛋白免疫阳性细胞较多,染色较深,呈棕黄色。结果显示,实验组比对照组细胞的E2F1蛋白表达增高。(Fig.5C,D)5 RT-PCR检测各组细胞中SIRT1mRNA和E2F1mRNA的表达对照组、40ug/ml VP-16作用组、81.30ug/ml VP-16作用组、120ug/ml VP-16作用组细胞SIRT1mRNA的光密度比值分别为1.33±0.05、1.02±0.03、0.84±0.03和0.61±0.02;E2F1mRNA的光密度比值分别为:0.85±0.04、1.10±0.05、1.38±0.06和1.69±0.08;结果显示:随着药物浓度的增加,各用药组细胞SIRT1mRNA表达明显降低,与对照组相比有显著差异(P<0.05);而E2F1 mRNA表达明显升高,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(Fig.6,Table 5)6 Western blot检测各组细胞中SIRT1蛋白和E2F1蛋白的表达对照组、40ug/ml VP-16作用组、81.30ug/ml VP-16作用组、120ug/ml VP-16作用组细胞SIRT1蛋白IOD比值分别为1.42±0.06、1.19±0.08、0.98±0.06和0.76±0.04;E2F1蛋白IOD比值分别为0.79±0.03、1.04±0.04、1.27±0.05和1.51±0.07;结果显示:随着药物浓度的增加,各用药组细胞SIRT1蛋白表达明显降低,与对照组相比有显著差异(P<0.05);而E2F1蛋白表达明显升高,与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(Fig.7,Table 6)。结论:1 VP-16可抑制BGC823细胞的增殖活性,且具有剂量依赖性和时间依赖性。2 VP-16可以将BGC823细胞阻滞在S期,诱导细胞凋亡。3 VP-16抑制BGC823细胞生长、诱导细胞凋亡与其可下调SIRT1表达、上调E2F1的表达有关。