新孢子虫病(Neosporosis),是由专性细胞内寄生的犬新孢子虫(Neospora caninum)感染所引起的疾病。犬新孢子虫属于顶复门(Phylum Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoasida)、球虫亚纲(Coccidia)真球虫目(Eucoccidiida)、肉孢子虫科(Sarcocystidae)新孢子虫属(Neospora),其形态与弓形虫相似。1984年,挪威Bjerkas等首次发现该原虫。1988年,美国的著名寄生虫学家Dubey将其与弓形虫相区别并命名为犬新孢子虫。自从首次分离出该原虫以来,新孢子虫所引起的疾病呈现全球性分布,犬新孢子虫的终末宿主是犬,中间宿主包括犬、牛、马、鹿、兔子和多种野生动物。该病对牛的危害严重,可以引起牛流产、木乃伊胎、胎儿自溶及新生胎儿运动和神经系统功能障碍。严重阻碍了牛的养殖业和肉牛的生产业的发展,造成的经济损失不容忽视。尽管到目前为止,国内外对新孢子虫抗原的研究很多,但我国目前还没有有效的疫苗和药物防治本病,快速准确做出诊断是最为有效的降低经济损失的方法。为寻找新型有效的具有开发诊断试剂潜能的犬新孢子虫抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术,构建犬新孢子虫速殖子的cDNA文库,利用新孢子虫感染的小鼠血清和全虫免疫的小鼠血清中的IgG抗体筛选文库,最后,对所筛选出的免疫应答相关蛋白基因进行初步分析。结果显示,构建的cDNA原始文库的文库容量约为6×106pfu,扩增后的文库滴度为3×10lopfu/mL,随机挑取生长独立的噬菌斑,经过PCR鉴定,发现插入基因片段多数存在于400bp左右。经过三轮淘选,共筛选出14个新孢子虫基因,经过比对分析,筛选出的基因编码蛋白包括微线体蛋白、棒状体蛋白、致密颗粒蛋白、蛋白质合成相关蛋白、核糖体蛋白和功能未知的假定蛋白,结果表明,所构建的文库质量较好,内含插入的基因多样化,推断筛选出的基因是犬新孢子虫中可以作为诊断性抗原标志的候选基因。本研究成功构建并筛选了犬新孢子虫速殖子的cDNA文库,为进一步利用这些抗原研制新孢子虫病诊断试剂和疫苗提供理论依据。另一方面,本研究选取犬新孢子虫两种已知的重要表面蛋白NcSAG1和NcSRS2,应用PCR方法扩增截短的新孢子虫NcSRS2基因,构建重组质粒pMD18T-NcSRS2和重组质粒pColdⅢ-NcSRS2,并将所构建的质粒pColdⅢ-NcSRS2和现有的质粒pGEX-NcSAGl转化入大肠杆菌BL21中进行原核表达和纯化,经SDS-PAGE鉴定表达产物,用BCA蛋白分析试剂盒对蛋白含量进行鉴定。然后,将表达的重组蛋白与一定倍数稀释的犬新孢子虫病阳性血清反应,显示这两种蛋白可以与抗新孢子虫的抗体特异性结合,表明NcSAG1和NcSRS2均是良好的诊断新孢子虫病的抗原,为进一步了解犬新孢子虫病的流行情况或者研发诊断试剂和免疫试剂奠定基础。