一、研究背景:近年来,四肢大段骨缺损的修复重建在临床治疗中已经取得了长足发展,但仍然是困扰骨科医生的最常见的难题之一,最理想的骨重建目标不仅实现骨缺损的愈合,同时需恢复患肢功能。目前治疗四肢大段骨缺损的主要方法分别有自体松质骨移植,Ilizarov骨搬移技术以及带血管腓骨移植技术,这些方法曾经在对于临床上治疗四肢骨缺损中做出了巨大的贡献,至今仍是该领域的经典技术,但是目前这几种骨重建技术仍然存在一定的局限性。自体松质骨移植一般仅适用于重建4-6cm以内的骨缺损,否则移植骨可能被吸收而导致骨重建失败,骨搬移技术治疗周期比较长,长时间佩戴大体积的外固定架给患者日常生活带来诸多不便,带血管腓骨移植修复大段骨缺损具有一定优势,但是需要较高的设备和技术要求,还容易出现骨连接不正、骨不愈合、供骨区和受骨区同时失败的风险和并发症[1-3]。2000年Masquelet等[4]报道了膜诱导技术治疗四肢节段性骨缺损,因为具有成功率高、并发症少、技术要求低等优势逐步被越来越多的骨科医师所认可,该技术治疗骨缺损主要通过两期手术完成,一期首先对缺损周围清创,去除感染、坏死的组织,局部填塞聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate PMMA)骨水泥诱导周围形成一层具有生物活性的膜,称为诱导膜,二期(6-8周后)在膜内填塞颗粒状自体松质骨修复骨缺损。早期研究报道显示该技术修复骨缺损成功率为88%~100%,能够成功修复长达25cm的骨缺损[5-7]。目前认为膜诱导技术修复四肢骨缺损成功率高的主要原因是骨水泥诱导形成的生物膜,它不仅能维持移植骨的形态,防止移植骨被周围组织吸收,同时能为移植骨成骨提供必须的血供及多种成骨生长因子,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等。但目前诱导膜的结构和功能、生长因子含量以及随时间变化情况尚不十分清楚。在本研究中,构建动物的骨缺损模型并成功诱导成膜后植入自体骨或灭活骨。通过影像学手段和组织学技术观察其成骨的差异。并且对比采用不同材料的骨水泥(PMMA骨水泥和磷酸钙骨水泥)诱导成膜的成分和功能,以及对其成骨情况的差异性研究。二、研究目的1、建立骨缺损诱导膜-骨重建动物模型,探讨诱导膜对骨缺损修复重建的作用。2、观察诱导膜能否促进移植骨的成骨过程。3、比较pmma骨水泥与磷酸钙骨水泥诱导周围形成膜的结构和成骨活性的差异。三、资料和方法第一部分第三军医大学动物实验中心提供健康成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重(2.35±0.12)kg,在动物手术室无菌条件下将新西兰大白兔双侧桡骨制造1.5cm骨缺损,同期植入聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥2g,缝合手术切口,常规条件下饲养。在6周后,手术去除pmma骨水泥,分组处理(6只/组):a组:pmma骨诱导膜保留+植入自体移植骨;b组:pmma骨诱导膜保留+植入灭活自体骨;c组:pmma骨诱导膜去除+植入自体移植骨;d组:pmma骨诱导膜去除+植入灭活自体骨。封闭兔子伤口处,患肢不做任何固定,常规饲养条件喂养。8、12周后通过放射学检测和组织学检测评估新生骨形成情况。第二部分32只健康成年新西兰大白兔按照随机数字表法分为pmma组和磷酸钙组,每组16只,双侧桡骨制造1.5cm骨缺损,分别植入pmma和磷酸钙骨水泥,4、6周后每组选取2只兔子取出骨水泥周围包裹的诱导膜比较膜厚度及血管密度;第4周取出骨水泥并在膜内植入自体松质骨,植骨后8、12周分别通过放射学和组织学评估新生骨形成的情况。四、结果第一部分1、在第一个实验得到的骨缺损修复放射学评分结果。实验兔放射学检测结果示,骨重建术后第8周实验组可见大量新生骨形成,与骨缺损两端连接,骨折线部分存在,模型组和对照组未见明显新生骨;第12周实验组骨缺损完全愈合,骨折线消失,骨髓腔部分再通,模型组可见少许新生骨痂形成,连接欠佳,对照组骨缺损两端呈硬化表现,未见新生骨形成和骨连接2、he染色观察新生骨和血管情况。二期骨重建术后8周实验组可见部分编织骨形成,以骨细胞和软骨细胞多见,模型组与对照组仅见纤维连接,未见骨细胞和软骨细胞;术后第12周实验组可见编织骨已向板层骨转化,模型组可见纤维软骨连接,部分骨细胞和软骨细胞,新生部分与骨缺损断端分界明显,对照组未见骨细胞和软骨细胞,仅可见纤维连接。第二部分1、膜的比较结果。检测结果显示在第4、6周pmma组膜的平均厚度为(1108±26)、(945±42)μm磷酸钙骨水泥组诱导成膜厚度为(945±34)、(778±22)μm(p<0.05)。pmma骨水泥诱导的膜血管密度分别为6、3个/μm2,而磷酸钙骨水泥诱导形成的膜血管密度分别为2、2个/μm2。2、elisa检测结果示在第4、6周pmma诱导膜中bmp-2,vegf含量明显高于磷酸钙骨水泥(p<0.05)。3、实验兔骨缺损重建模型放射学检测可见二期处理后第8、12周实验组成骨优于模型组和对照组(p<0.01),模型组有少许骨痂形成,对照组无成骨;第8、12周组织学观察实验组可见骨细胞和软骨细胞形成,成骨优于模型组和对照组(p<0.01),对照组仅有纤维连接,未见骨细胞和软骨细胞。4、masson染色观察新生骨和血管情况。植骨后8周pmma组可见编织骨形成,骨细胞和软骨细胞多见,磷酸钙组仅见纤维连接无骨细胞和软骨细胞。植骨后12周pmma组见编织骨向板层骨转化,磷酸钙组骨痂形成较少。统计学分析表明,第8、12周pmma组骨缺损修复情况明显优于磷酸钙组(p<0.05)。5、①4、6周时pmma骨水泥组诱导形成的膜厚度分别为(1108±26)、(945±42)μm,磷酸钙骨水泥组诱导成膜厚度为(945±34)、(778±22)μm,两组间差异有统计学意义(p<0.05)。pmma骨水泥诱导的膜血管密度为6个/μm2,而磷酸钙骨水泥诱导形成的膜血管密度为2个/μm2。②放射学检测可见植骨后第8、12周pmma组成骨按lane-sandhux线评分(2.84±0.36、4.22±0.54)优于磷酸钙组(1.98±0.15、3.16±0.23),两组间差异有统计学意义(p<0.05);③第8、12周组织学观察pmma组按nilsson组织学评分标准进行评分(3.14±0.29、4.63±0.37),成骨优于磷酸钙组(2.10±0.18、3.59±0.21),两组间差异有统计学意义(p<0.05)。五、结论1.骨诱导膜通过向骨缺损部位提供成骨相关细胞和高浓度的成骨因子从而促进骨缺损的修复重建。2、诱导膜组织中各种生长因子在第4-6周达到高峰并趋于成熟。3.PMMA骨水泥诱导形成的生物膜较磷酸钙骨水泥诱导形成的生物膜具有更强的促血管化和成骨活性。