褐藻是重要的初级生产者,大量细菌生活在褐藻表面,褐藻与附生细菌之间存在着复杂的关系。附生细菌可以产生特定的酶来降解褐藻。褐藻胶在褐藻细胞壁中含量丰富,可达到藻类干重的30-60%,因此褐藻是分离褐藻胶降解菌株的重要来源。褐藻胶降解菌可将褐藻胶作为碳源代谢。目前,已有两种细菌的褐藻胶代谢通路被报道:一种来自拟杆菌的黄杆菌,一种来自变形杆菌的鞘氨醇单胞菌。到目前为止,尽管许多可培养的附生细菌已经从褐藻中分离出来,但仍有很多褐藻附生菌,包括褐藻附生降解菌尚未被研究。并且很多褐藻胶降解细菌的褐藻胶代谢通路尚不清楚。挖掘褐藻中的褐藻胶降解菌也有望发现新的褐藻胶降解酶,为开发褐藻寡糖制备工具酶奠定基础。马尾藻是分布在温带、热带和亚热带的大型褐藻,包含24属500多种。马尾藻的褐藻胶含量较高,占其干重的50%以上。因此,马尾藻是分离褐藻胶降解菌的良好材料。然而目前只有少数关于马尾藻附生细菌和褐藻胶降解菌的研究。研究马尾藻相关的附生褐藻胶降解菌有助于理解马尾藻与附生细菌之间的相互作用,以及对褐藻胶降解菌和新型褐藻胶降解酶的开发利用。本论文首先以采集自山东省沿海海域的马尾藻样品为研究对象,筛选了可培养附生细菌和褐藻胶降解菌株,分析了菌株多样性,并检测了褐藻胶降解菌株产胞外褐藻胶裂解酶的能力。之后通过基因组、转录组、蛋白质组和分泌组,进一步分析了筛选得到的褐藻胶高效降解菌株Vibrio sp.C42和Pseudoalteromonas sp.M9的褐藻胶代谢通路,并对菌株V.sp.C42分泌的双催化结构域褐藻胶裂解酶AlyC8的酶学性质进行了研究,对菌株P.sp.M9分泌的新型褐藻胶裂解酶AlyM2的应用潜力进行了评价。（1）马尾藻样品附生菌及褐藻胶降解菌的筛选和多样性分析利用稀释平板法从采集自山东沿海海域的马尾藻样品中分离纯化可培养附生细菌以及褐藻胶降解菌株,并分析它们的多样性。共分离到37株细菌,基于16S r RNA基因序列分析,这些马尾藻附生细菌隶属于3门21属,Vibrio（6/37）和Pseudoalteromonas（5/37）为优势属。其中15属为首次报道的马尾藻附生细菌。其中8株菌株被鉴定可以分泌褐藻胶裂解酶,分布在Alteromonas（1/8）、Pseudoalteromonas（4/8）和Vibrio（3/8）3个属中。对褐藻胶降解菌的产胞外褐藻胶裂解酶能力进行分析,发现菌株V.sp.C42和P.sp.M9的胞外褐藻胶裂解酶活性最高。这些结果为更好地了解马尾藻附生细菌提供了依据,有助于进一步研究马尾藻与附生细菌间的相互作用,以及附生褐藻胶降解菌及其酶的开发利用。（2）菌株Vibrio sp.C42的褐藻胶代谢通路分析虽然目前对弧菌褐藻胶代谢基因及基因簇已经有一些报道,但对于弧菌属细菌褐藻胶代谢通路尚不完全清楚。为了揭示马尾藻附生褐藻胶降解菌V.sp.C42的褐藻胶代谢通路,对菌株V.sp.C42进行了基因组测序,分析了其褐藻胶代谢相关基因,包括褐藻胶裂解酶基因以及位于褐藻胶利用位点（AUL）中的基因。通过转录组和蛋白质组检测,验证了可能在褐藻胶代谢中发挥功能的基因。通过分泌组分析,进一步检测了胞外褐藻胶裂解酶。结合多组学分析结果,最终预测了菌株V.sp.C42的褐藻胶代谢通路:菌株V.sp.C42利用9个胞外的外切或内切的褐藻胶裂解酶,将褐藻胶降解为寡糖和单糖产物。产物通过外膜的孔蛋白进入周质空间,并通过内膜的钠溶质转运体、TTT转运体进入胞内,被胞内的一个外切褐藻胶裂解酶进一步降解为单糖。单糖通过一系列酶的催化（Deh R、Kdg F、Kdg K和Eda）被逐步代谢,最终进入糖酵解途径。Gnt R蛋白调控了菌株V.sp.C42对褐藻胶的代谢。菌株V.sp.C42的褐藻胶代谢关键基因与已报道的弧菌的基本一致,但不同的是,本论文首次在AUL中发现内膜上的TTT转运体可能也参与了褐藻胶降解产物的转运。此外,弧菌褐藻胶代谢通路与拟杆菌门的褐藻胶代谢通路类似,但它们的转运系统存在明显不同。对弧菌褐藻胶降解通路的研究有益于拓宽对弧菌与马尾藻之间关系的认识,也为更好的利用弧菌资源奠定基础。（3）菌株Pseudoalteromonas sp.M9的褐藻胶代谢通路分析Pseudoalteromonas是重要的褐藻胶降解类群,但其褐藻胶代谢途径尚不清楚。为了揭示马尾藻附生褐藻胶降解菌P.sp.M9的褐藻胶代谢通路,对菌株P.sp.M9进行了基因组测序,分析了其褐藻胶代谢相关基因,包括褐藻胶裂解酶基因以及位于AUL中的基因。通过转录组和蛋白质组检测,验证了可能在褐藻胶代谢中发挥功能的基因。通过分泌组分析,进一步检测了胞外褐藻胶裂解酶。结合多组学分析结果,最终预测了菌株P.sp.M9的褐藻胶代谢通路:菌株P.sp.M9的5个褐藻胶裂解酶都被分泌至胞外空间,将褐藻胶完全降解为单糖。单糖通过外膜的Sus C转运蛋白、内膜的MFS蛋白被最终转运至胞内,随后通过Deh R、Kdg F、Kdg K和Eda被逐步代谢,最终进入糖酵解途径。本论文首次系统分析预测了Pseudoalteromonas属的褐藻胶代谢通路,其与拟杆菌门以及弧菌褐藻胶代谢通路类似,但在外膜转运蛋白方面存在明显不同。此外,在菌株P.sp.M9中未发现明显的褐藻胶代谢调控基因,暗示其可能存在新的调控机制。该结果有助于拓宽对Pseudoalteromonas的认识,更好的认识Pseudoalteromonas与马尾藻之间关系,也为更好的利用Pseudoalteromonas的酶资源奠定基础。（4）PL7家族双催化结构域褐藻胶裂解酶AlyC8的异源表达与性质研究绝大多数已报道的褐藻胶裂解酶仅含有一个褐藻胶催化结构域,目前只有褐藻胶裂解酶AlyA和Algb被报道具有两个褐藻胶催化结构域,但其中每个催化结构域的性质未被分析比较。本论文对菌株V.sp.C42的褐藻胶裂解酶的分析发现,褐藻胶裂解酶AlyC8可能含有两个PL7催化结构域AlyC8-CD1和AlyC8-CD2。对AlyC8、AlyC8-CD1和AlyC8-CD2进行了异源表达、纯化,并进一步研究了它们的酶学性质。AlyC8的最适温度是30°C,最适p H为9.0;AlyC8-CD1的最适温度是30°C,最适pH为8.0;AlyC8-CD2的最适温度是40°C,最适pH为8.0,说明他们均能够适应海洋环境,并可以在相似的环境中发挥高降解活性。对AlyC8、AlyC8-CD1和AlyC8-CD2的活性、降解产物和动力学参数进行分析,发现AlyC8-CD1在全酶中发挥主要作用。然而,在底物特异性分析中发现,AlyC8-CD1对PM的降解活性最高,但对PG几乎没有降解活性;相反的,AlyC8-CD2对PG活性最高,而对PM活性最低。AlyC8-CD1和AlyC8-CD2在底物选择性上的互补使得AlyC8全酶对四种褐藻胶底物都具有显著的降解活性,体现了AlyC8-CD1和AlyC8-CD2的协同作用。与AlyA和Algb的报道相比,本论文首次发现了一个双催化结构域均具有褐藻胶裂解活性的褐藻胶裂解酶,并揭示了其两个结构域对褐藻胶的协同降解作用。（5）PL6家族褐藻胶裂解酶AlyM2的异源表达、性质及应用潜力分析褐藻胶寡糖（AOs）具有多种生物活性,在益生元、营养补充剂、植物生长发育等方面有着重要的应用。褐藻胶裂解酶在AOs的制备方面具有独特的优势。然而到目前为止,只有少量的褐藻胶裂解酶被报道具有制备特定聚合度低聚糖（DPs）的潜力。在对菌株P.sp.M9的褐藻胶裂解酶分析中发现该菌株含有5个褐藻胶裂解酶AlyM1-M5。成功纯化了AlyM1、AlyM2、AlyM3和AlyM5,并分析了它们对褐藻酸钠的降解产物,其中AlyM2主要生成三糖,占所有产物的79.9%。进一步对AlyM2进行序列比对以及结构预测,发现AlyM2是一种新型PL6家族褐藻胶裂解酶,可能有新的催化机制。AlyM2的酶学性质研究表明它的最适温度是30°C,最适p H为8.0,最适Na Cl浓度是0.5 M。AlyM2对四种褐藻胶底物（PM,PG,PMG和褐藻酸钠）均有降解活性,对PMG的活性最高。降解产物都以三糖为主,三糖占比均为80%左右。以褐藻酸钠为底物时的三糖产量为588.4 mg/g。以上结果表明AlyM2在生产各种褐藻三糖方面具有较好的应用潜力。本论文揭示了马尾藻附生菌与附生褐藻胶降解菌的多样性,通过对V.sp.C42褐藻胶代谢通路的分析完善了对Vibrio属褐藻胶代谢通路的了解,首次分析了以P.sp.M9为代表的Pseudoalteromonas细菌的褐藻胶代谢通路。同时,阐明了来自菌株V.sp.C42的PL7家族双催化结构域褐藻胶裂解酶AlyC8其两个结构域的协同作用,并评价了菌株P.sp.M9的PL6家族褐藻胶裂解酶AlyM2在褐藻三糖制备方面的应用潜力。研究结果有助于更好地了解褐藻与其附生菌之间的相互作用,并为挖掘与褐藻胶降解利用相关的菌株和酶资源奠定了基础。