乳腺癌的发病率呈每年上升的趋势,在女性恶性肿瘤死亡原因中占第二位。它是一类危害妇女健康的主要恶性肿瘤,其常规的治疗方法主要有化疗、放疗、手术和内分泌治疗等,但是与其它的很多恶性肿瘤一样,乳腺癌的多药耐药(mulfidrugresistance, MDR)特性严重地限制了化疗的实施。肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药性,尤其是多药耐药性,是恶性肿瘤化疗失败的主要原因,也是肿瘤化疗领域中急需解决的难题。乳腺癌的多药耐药是指肿瘤细胞对某种抗肿瘤药物产生耐药的同时,对作用机制和结构完全不同的其它抗肿瘤药物也存在耐药的特性,它形成的机制主要包括肿瘤细胞减少对药物的迸入而泵出药物相对增多,药物靶点的改变,细胞周期检测点的紊乱,DNA损伤修复系统障碍以及细胞凋亡途径变化等。克服多药耐药有两种方法首先是开发对MDR肿瘤细胞不具有抗药性的新抗癌药物,其次是寻找MDR逆转剂与抗癌药物合用,恢复MDR肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。虽然目前有很多乳腺癌多药耐药逆转剂在动物模型和体外细胞培养中都具有很好的逆转功效,但是在实际的临床实验中,这些耐药逆转剂由于干扰传统的抗癌药物药代动力学、还由于因可引起严重的毒副作用等,至今都没有取得预期的临床效果,因此急需开发新的有效逆转剂来逆转MDR。P-gp是多药耐药基因-1(multidrug resistance gene-1, MDR-1)编码的一种跨膜转运蛋白,能将化疗药物从细胞内泵出,降低细胞内的有效药物浓度从而导致多药耐药,具有ATP酶活性。EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer, CD147, basigin)为单次跨膜糖蛋白,在肿瘤细胞表面高表达,是免疫球蛋白超家族成员,能促进成纤维细胞或肿瘤细胞产生MMPs,和肿瘤的浸润转移密切相关。基质金属蛋白酶(matrix metaloproteinases, MMPs)是目前已知的能够降解胶原纤维的唯一酶类,参与肿瘤细胞对细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和基底膜(basement membrane, BM)的降解,是一族锌肽酶超家族。基质金属蛋白酶在很多转移癌中的表达明显增高,与肿瘤转移密切相关。基质金属蛋白酶成员中,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9,MMP-9)因为能够特异性地降解细胞基底膜和细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原,从而在肿瘤侵袭转移过程中发挥最重要和最直接的作用。耐药的肿瘤细胞与敏感细胞相比,表达更高的CD147和MMPs,同时还发现P-糖蛋白底物能促进耐药肿瘤细胞的EMMPRIN和MMPs表达,增强肿瘤细胞的浸润转移能力,这些实验表明临床上不恰当的化疗对肿瘤患者的病情产生不利的影响,还有可能促进癌细胞的浸润转移。用有效逆转多药耐药的药物逆转肿瘤耐药,能否同时影响肿瘤的浸润转移特性,目前文献报道甚少。中药治疗肿瘤不仅作用途径比较广泛,而且毒副作用小。近年来,大量的实验研究表明,许多复方制剂及单味中药的有效成分在体外实验中有逆转肿瘤细胞MDR的作用。人参皂苷Rh2(Ginsenoside-Rh2)具有抗衰老、抗疲劳、抗血小板聚集、抗辐射等多种生物功能,是五加科人参属植物的主要活性成分。随着研究的深入,该类化合物在癌症的治疗和预防方面具有很强的活性。人参皂苷可通过多种机制发挥其抗肿瘤活性,如逆转耐药,提高化疗药物敏感性；直接抑制瘤细胞的生长；诱导瘤细胞的凋亡及分化；作用于肿瘤侵袭的多个环节抑制肿瘤的转移；影响代谢和调节免疫功能；也可通过影响细胞内多种酶活性,增强机体对疾病的抵抗能力,从而间接地抑制肿瘤的生长。针对人参皂苷逆转MDR的作用,研究发现,人参皂苷Rg3可以增加KBV20C对多种化疗药物的敏感性；并且抑制了罗丹明123从KBV20C细胞内的外排。人参皂苷Rh2在实验所选定的剂量下对B16-BL6细胞自发性肺转移具有明显的抑制作用,其作用机制与抑制基质金属蛋白酶有关,并证明人参皂苷Rh：对正常细胞毒性作用甚低。但有关人参皂苷Rh：逆转肿瘤耐药的同时影响肿瘤的浸润转移作用的研究尚未见报导,因此,本研究以耐阿霉素乳腺癌细胞系(MCF7/AdrR)作为靶细胞,研究人参皂苷Rh：对耐药细胞的耐药逆转作用,并从诱导耐药细胞的凋亡及人参皂苷Rh2对耐药侵袭转移相关基因表达的影响,阐明人参皂苷Rh2逆转耐药的可能机制。实验结果如下：1.MTT检测结果显示5-40μmol／L的GS-Rh2对MCF7/Adr无明显细胞毒作用,细胞存活率大于90%,MCF7/Adr对0.2-1.0μg／mL的ADM完全耐受,细胞存活率大于95%。2.检测结果显示5-40μmol/L的人参皂苷Rh2与1.0μg/mL的ADM联合应用,细胞存活率明显下降,细胞存活数分别是单用ADM组的63%,50%,31%,28%,通过流式细胞仪检测细胞内荧光强度发现,5-40μmol/L的人参皂苷Rh2与1.0μg/mL的ADM联合应用细胞,细胞内ADM的荧光强度明显升高,细胞内ADM荧光强度分别是ADM单独作用组的1.09,1.55,1.61,2.37倍,其差异均具有显著性意义。3.荧光显微镜显示MCF7/AdrR细胞经GS-Rh2作用后呈较明显的凋亡形态学改变,ADM+Rh2不同浓度组细胞核数目明显减少,有大量固缩变形的细胞核,染色质浓缩,表现为浓染致密的荧光颗粒,有凋亡小体形成,尤其ADM与Rh2大剂量联合用药组凋亡最明显。4.流式细胞仪检测证实,GS-Rh2能在一定浓度范围内诱导MCF7/AdrR细胞凋亡,GS-Rh2与ADM联合作用组的凋亡率为(47.08%),高于对照组(8.51%)和阿霉素组(15.20%)(P均<0.05)。Rh2+ADM各浓度组作用于MCF7/AdrR细胞株均出现诱导G0/G1期阻滞,阻滞细胞由G1期向S期的转化,随Rh2作用浓度的增加G0/G1期细胞含量上升,S期细胞下降,G2/M期与对照组比较无明显的变化。5.Rh2组和ADM组的Fas、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达与对照组比较差异无统汁学意义。ADM+Rh2不同浓度组作用于MCF7/AdrR细胞使Fas、Bax蛋白的表达增高,Rh2浓度为40μmol/L时蛋白表达增高最明显,Bcl-2蛋白的表达降低,Bcl-xL蛋白的表达在药物作用前后无明显的变化。6.首先RT-PCR和Western blot检测结果显示1.0μg/mLADM作用于MCF7/Adr细胞,与对照组相比,细胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、MMP2、MMP9蛋白和mRNA水平升高,进而又观察了人参皂苷Rh2对细胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、MMP2、MMP9表达的影响。结果显示当人参皂苷Rh2与ADM联合应用时,人参皂苷Rh2也能明显抑制ADM对细胞上述蛋白和mRNA水平的上调,且人参皂苷Rh2对上述蛋白表达的下调与人参皂苷Rh2浓度相关,呈浓度依赖性。7.人参皂苷Rh：作用于MCF7/Adr细胞后,经transwell chamber实验检测,结果发现ADM+Rh2不同浓度组与对照组相比细胞穿过覆盖Matrigel或没有覆盖Matrigel带孔滤膜的数目均有所减少；与对照组相比人参皂苷Rh2明显抑制了MCF7/Adr细胞侵袭与转移,其抑制率分别为16%、26%、49%、74%和18%、23%、52%、78%。而ADM组与对照组相比,MCF7/Adr细胞穿过覆盖Matrigel或没有覆盖Matrigel带孔滤膜的数目增多。以上结果提示：1.人参皂苷Rh2可以有效逆转乳腺癌细胞耐药细胞系MCF7/ADM的耐药性,是一种安全、高效的MDR逆转剂。其耐药逆转作用与P-gp有关,人参皂苷Rh2有可能直接或间接作用于P-gp,使其功能减退或失活,Rh2作为钙通道阻滞剂与抗肿瘤药物竞争P-gp的结合位点,从而抑制其跨膜泵作用,使抗肿瘤药物的细胞外排降低,提高细胞内药物浓度而逆转耐药。2. GS-Rh2能抑制体外培养的MCF7/AdrR细胞增殖并诱导其凋亡。3.诱导MCF7/AdrR细胞凋亡可能是通过上调Fas、Bax表达、下调Bcl-2表达以及阻滞细胞周期而实现。4.人参皂苷Rh2能抑制ADM对P-gp、EMMPRIN、MMP1、MMP2和MMP9的上调作用,降低细胞体外侵袭、迁移能力,MMP2和MMP9主要参与了人参皂苷Rh2对MCF7/Adr细胞侵袭和迁移能力的调节。