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G蛋白偶联受体(GPCR)是一类重要的细胞膜表面受体超家族,与激素、神经递质、气味及其它小分子结合激活,介导多种配体信号,调节广泛的生理功能和药物作用。G蛋白偶联受体激酶(GRK)是负反馈调节GPCR的一类关键的丝苏氨酸激酶。GPCR被激动剂激活后,GRK能够特异性地结合受体,迅速磷酸化受体的胞内段,抑制受体的持续激活,介导受体内吞和脱敏。GRK有七种亚型,分为三个亚家族。其中GRK5广泛分布于全身多种器官,高表达于心脏、肺、骨骼肌、脑等器官,对多种GPCR具有选择性的调节作用,参与调节多种多样的生理现象和病理过程。最近也有一些研究发现GRK5不仅是GPCR的负性调控激酶,而且以其它不同的调节机制发挥作用。本研究首次探讨了GRK5对血管新生(angiogenesis)的影响。血管新生主要发生在生理性发育及成体创伤愈合、女性月经周期等过程,受到精密的促血管新生因子和抑制因子的平衡调控,一旦失衡则会导致多种疾病。由于在肿瘤生成、转移及很多疾病中的重要影响,血管新生在病理过程中的意义和机制已被更多研究关注。我们最新发现GRK5在血管新生过程中具有重要调节作用,并对GRK5在血管新生中的作用机制作了进一步研究。我们的主要研究结果如下：1、我们发现GRK5在人和小鼠多种器官的血管内皮细胞中均有高表达。在GRK5敲除(GRK5-/-)小鼠早期胚胎发育中,头部及躯干部的血管发育迟缓。通过在斑马鱼胚卵中下调GRK5,发现胚胎发育中躯干部的血管新生过程受影响,血管发育迟滞。过表达野生型的GRK5及其激酶缺失突变体K215R,能够缓解内源蛋白下调导致的血管发育迟缓。这些结果提示,GRK5在胚胎发育过程中的血管新生中有促进作用。2、我们进一步探索了GRK5在肿瘤血管新生中的作用。GRK5-/-小鼠在野生型肿瘤细胞接种的荷瘤模型中,肿瘤生长速度减慢,形成的肿瘤体积小于野生型小鼠,肿瘤内坏死组织增多,形成的微血管数和微血管密度减少。在皮肤创伤愈合实验中,GRK5-/-小鼠伤口愈合时间久。这些结果提示,GRK5的缺失使肿瘤形成、创伤愈合等病理性过程减缓,并表现在新生微血管的减少,证明GRK5有调控病理性血管新生的作用。3、已知血管新生是由VEGF等促血管新生因子使内皮细胞活化、迁移导致的结果。为探讨GRK5在发育或病理性血管新生中的作用机理,我们在小鼠皮下接种含有血管内皮生长因子的胶质基底膜团块,发现GRK5-/-小鼠迁移长入的宿主血管内皮数明显少于野生型小鼠。GRK5-/-小鼠分离出的主动脉环迁移生长出的内皮细胞数少于野生型小鼠。原代分离培养的小鼠内皮细胞和原代人脐静脉内皮细胞中,缺失GRK5均导致细胞平面迁移能力减弱,体外基底膜上成管能力受损。在脐静脉内皮细胞中RNAi敲减GRK5后,细胞受VEGF诱导的迁移与成管能力均明显减弱。这些结果表明GRK5缺失会影响血管内皮细胞的迁移能力及血管样结构形成能力,提示GRK5在血管新生中的影响作用,主要是调控了血管内皮的活化迁移功能。4、通过荧光标记血管内皮中的细胞骨架,我们发现内皮细胞缺失GRK5后易化细胞运动的波纹样褶皱(：ruffle)减少,小G蛋白RhoA活性依赖的应力纤维(stress fiber)增强。并且应力纤维增强现象能被RhoA抑制剂C3及RhoA下游的效应蛋白ROCK抑制剂Y27632所逆转；GRK5缺失后RhoA-ROCK活性依赖的、与细胞外基质间形成的黏着斑效应增强,肌球蛋白磷酸化增强,均证明GRK5存在对RhoA的负性调控作用。内皮细胞受VEGF刺激或机械牵张产生的波纹样褶皱增多,也无法在GRK5缺失的细胞中诱导产生。这些结果都提示,GRK5对血管内皮运动能力的调控主要是通过调节RhoA-ROCK信号通路来实现的。5、通过生化实验,我们进一步证实了GRK5对RhoA活性的负性调控：即GRK5缺失上调细胞内源GTP-RhoA量,细胞内过表达GRK5后GTP-RhoA量则下降。我们发现GRK5与RhoA有直接的相互作用,且主要通过与RhoA非活性形式形成复合体。这些结果提示,GRK5对RhoA-ROCK活性的调控可能通过与GDP-RhoA的结合,抑制了RhoA下游信号。6、GRK5能与内皮细胞受VEGF刺激或机械牵张力作用产生的细胞膜表面的波纹样褶皱共定位,并且内皮细胞受VEGF刺激后细胞膜上的GRK5表达量上调。这个结果提示,GRK5对细胞运动迁移的调节,是在激动剂诱导下改变了在细胞内的亚定位,招募上膜从而发挥功能。已知GRK5的氨基端存在与膜成分PIP2相结合的结构域。我们在细胞上过表达无法上膜的突变体N-PBA及不与F-actin相结合的突变体C-PBA,发现无法产生像野生型GRK5一样的应力纤维减少的现象。并且这一突变体在斑马鱼胚胎中的过表达也无法缓解内源GRK5蛋白下调导致的血管新生阶段的血管发育迟缓。因此提示,GRK5受上游信号刺激上膜,能抑制血管内皮细胞RhoA过度活性,从而促进血管新生。本研究首次发现GRK5对肿瘤和发育阶段血管新生的调节作用,并且证明了对血管内皮细胞的诱导迁移调节作用的可能机制,即细胞在激动剂刺激下,发生GRK5从细胞浆到细胞膜的定位转化,GRK5通过结合小G蛋白RhoA,并抑制RhoA活性,从而促进病理性肿瘤及生理发育的血管新生。本文的研究为GRK5作为血管新生在临床肿瘤的诊断、治疗中,成为潜在的靶点提供坚实的理论依据。