目的探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib）对多发性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）细胞株U266生长、增殖及凋亡的作用，以及硼替佐米和骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）对U266细胞趋化能力及其趋化因子受体1（C-C chemokine receptor type1，CCR1）、趋化因子受体（2C-C chemokinereceptor type2，CCR2）、趋化因子受体3（C-C chemokine receptor type3，CCR3）、基质细胞衍生因子-1受体(stromal cell derived factor-1receptor，SDF-1R/CXCR4)、趋化因子受体6(CC chemokine receptor type6，CCR6)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，HGFR/c-Met)mRNA表达水平的影响，进而揭示MM细胞趋化功能的改变在骨髓瘤疾病进程中的作用。方法多发性骨髓瘤细胞株U266置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的1640培养液中培养，运用MTT法及流式细胞仪检测不同浓度硼替佐米对U266细胞的生长、增殖及凋亡作用，继而以2.5nmol/L硼替佐米作用U266细胞48小时后，实时荧光定量PCR方法检测U266细胞CCR1、CCR2、CCR3、CXCR4、CCR6、c-Met mRNA表达水平的变化。Transwell模型检测硼替佐米处理前后U266细胞在基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α（macrophage inflammatory protein1-alpha，MIP-1α）、MM患者MSC（MM-MSC）上清及正常人MSC（normal-MSC，N-MSC）上清作用下的迁移能力变化。收集培养10例初发MM患者骨髓MSC（MM-MSC）及7例正常对照组骨髓MSC(N-MSC)，采用密度梯度离心法体外分离培养骨髓MSC，取P2-4代MSC与U266细胞共培养48h或共培养过程中加入2.5nmol/L硼替佐米作用48h，实验分为4组：U266细胞与MM患者骨髓MSC共培养组（U266+MM-MSC组）、U266细胞与MM患者骨髓MSC共培养过程中加入2.5nmol/L硼替佐米组（U266+MM-MSC+硼替佐米组）、U266细胞与正常人骨髓MSC共培养组（U266+N-MSC组）及U266细胞与正常人骨髓MSC共培养过程中加入2.5nmol/L硼替佐米组（U266+N-MSC+硼替佐米组），48小时后收获U266细胞，运用实时荧光定量PCR方法检测CCR1、CCR2、CCR3、CXCR4、CCR6、c-MetmRNA表达水平，Transwell模型检测共培养后U266细胞的迁移能力。结果1.硼替佐米可抑制U266细胞的生长增殖及促其凋亡作用，并且随着硼替佐米浓度的增加及作用时间的延长，其生长抑制率及凋亡率逐渐增加，呈时间及剂量的依赖性。2. SDF-1、MCP-1、MIP-1α、MM-MSC上清及N-MSC上清均能增强U266细胞的趋化迁移能力(P<0.05)，同时与SDF-1及MCP-1相比较，MM-MSC及N-MSC上清对U266细胞的趋化作用更明显(P<0.05)，而硼替佐米则可抑制U266细胞在SDF-1、MIP-1α、MM-MSC及N-MSC上清等作用下的迁移能力，并且可降低U266细胞CCR1、CCR2、CCR3、CCR6、c-Met mRNA的表达水平(P<0.05)。3.将U266细胞分别与MM-MSC及N-MSC共培养后，两者均可增强U266细胞CCR1、CCR2及CCR6mRNA的表达水平(P<0.05)，同时MM-MSC还可增强U266细胞CCR3mRNA的表达水平(P<0.05)，并且CCR1mRNA表达水平在与MM-MSC共培养组增高更明显(P<0.05)，而CXCR4的表达水平在与MM-MSC共培养后则降低(P<0.05)；与MM-MSC及N-MSC共培养前后U266细胞在SDF-1作用下的趋化能力均无明显变化（P＞0.05）。4.在硼替佐米作用U266细胞过程中加入MM-MSC或N-MSC后，与硼替佐米单独作用U266细胞相比，加入MM-MSC及N-MSC后均可明显减弱硼替佐米对CCR1、CCR6mRNA表达的抑制作用（P<0.05），并且这种作用在MM-MSC组更明显。但是加入N-MSC后却能增强硼替佐米对CXCR4及c-Met的抑制作用（P＜0.05）。结论SDF-1、MCP-1、MIP-1α、MM-MSC上清及N-MSC上清均能增强U266细胞的趋化迁移能力，而且MM-MSC及N-MSC上清增强U266细胞趋化能力的作用更明显；硼替佐米不仅可抑制U266细胞的生长增殖及促其凋亡作用，还可以阻断上述多种趋化因素对U266细胞的趋化能力，并且可在基因水平抑制CCR1、CCR2、CCR3、CCR6、c-Met mRNA的表达。与MM-MSC共培养48小时后，MM-MSC对MM细胞在SDF-1作用下的趋化能力虽然无明显影响，但是却可以增强U266细胞CCR1、CCR2、CCR3及CCR6mRNA的表达水平。同时MM-MSC及N-MSC还可减弱硼替佐米对U266细胞CCR1及CCR6mRNA表达的抑制作用，并且这种作用在MM-MSC组更明显，说明MM-MSC与MM的耐药机制及疾病进展相关。目的通过基因芯片检测正常人骨髓间充质干细胞（N-MSC）与骨髓瘤细胞共培养后其基因表达谱的变化，分析筛选出MSC在调控骨髓瘤细胞趋化、凋亡以及耐药等过程中的关键基因，进一步阐明MSC在MM疾病进程中的作用机制。方法1.在6孔塑料培养板上架起孔径0.4μm的Transwell小室，建立双层细胞共用培养液而不直接接触的共培养体系，利用Transwell小室作为培养体系上层，接种P2-4代N-MSC（1×104cells/孔）；培养体系下层为6孔塑料培养板，接种等量混合的U266和8226细胞（1×105cells/孔），予37℃、5％CO2饱和湿度培养箱常规培养7天，培养液为含10％FBS的L-DMEM培养液，其中N-MSC单独培养组为对照组。2.结束培养后收集MSC，提取总RNA并纯化后，将RNA反转录为双链cDNA，用Cy5-dCTP，Cy3-dCTP分别标记MSC cDNA探针，与芯片杂交并清洗后，用Roche-NimbleGen的MS200扫描仪扫描芯片，采用GenePixPro4.0图像分析软件进行分析。3.以2倍差异显著性为标准，即Cy5/Cy3＞2为上调基因，Cy5/Cy3＜0.5为下调基因，对所获差异表达基因以软件进行功能查询并结合Cy5/Cy3比值，找到MSC在MM疾病进程中可能起关键作用的基因。同时选出差异表达比较明显的4个基因：转谷氨酰胺酶2（transglutaminase2，TGM2）、趋化因子7（C-Cmotif chemokine7，CCL7）、微原纤维相关蛋白5（microfibri associated protein5，MFAP5）、成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor2,FGFR2）进行定量PCR的验证。结果1.正常人骨髓MSC与MM细胞共培养后，与单独培养相比较，在总共分析的10001个基因中共发现837个差异基因(837/10001,8.37%)，其中有472个基因表达上调(472/837,56.39%)，365个基因表达下调(365/837,43.61%)。这些差异基因涉及细胞的生长分化、信号转导、免疫调节及炎症反应、趋化以及抗凋亡等多种生物学功能。2.定量PCR结果进一步证实正常人骨髓MSC与MM细胞共培养后，TGM2及CCL7基因表达较单独培养组明显增高，而MFAP5、FGFR2的表达共培养后则降低，同基因芯片结果一致。结论正常人骨髓MSC与MM细胞共培养后，在细胞生长分化、信号转导、免疫调节及炎症反应、趋化以及抗凋亡等多种生物学功能均发生变化，这种变化提示MM-MSC可能在MM的病程进程中具有重要作用。