炎症反应(Inflammation)作为生物机体对致炎因子所发生的自动的防御反应,主要表现为红(Redness)、肿(Swelling)、执(Heat)、痛(Pain)和功能障碍(Loss of Function)五大医学临床症候,尤其是发热、红肿、疼痛这些临床症候与中医的“热”证型如高热、汗出、舌红苔黄、肌肤生疮等症候相似。据中医的病因病机观点,“阳胜则热”,机体感受热邪、或外感寒邪化热、或内有郁积化热而致“热”证,中医对“热”证(炎症)的治则多以清热解毒、活血化瘀、通络止痛等,具有这些功效的中药如金银花、连翘、蒲公英等,被称为“抗炎中药”。虽然“抗炎中药”已表现出良好的临床治疗效果,但由于这类中药的抗炎机制不明确,加上中医方剂的变化,使“抗炎中药”的应用受到严重制约。因此,应用现代医学和分子生物学的理论和技术研究“抗炎中药”,以明确“抗炎中药”的抗炎机制,为“抗炎中药”能在医学或兽医学临床上广泛应用提供基础。本试验根据中医清热解毒、活血化瘀的治则,拟定中药方“蒲和饮”。通过建立小鼠炎症模型,观察中药方”蒲和饮”对炎症模型小鼠的治疗效果,并应用病理组织学技术、实时荧光定量RT-PCR (Real-time Quantitative RT-PCR)技术、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)技术研究“蒲和饮”的抗炎效果及抗炎固有免疫机制,以期明确其抗炎作用靶点,为其进一步研发提供依据。主要研究结果如下1.中药方“蒲和饮”抗炎效果研究为研究中药方剂“蒲和饮”对炎症的抑制效果,本试验通过建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和10%鲜鸡蛋清致小鼠足趾肿胀模型来研究“蒲和饮”的对急性炎症抑制效果,并确定最佳用药剂量。结果表明,中药方剂“蒲和饮”能显著降低二甲苯炎症模型小鼠的耳廓肿胀度和肿胀率(P<0.01)；其“蒲和饮”高剂量(160mg/kg)、中剂量(8Omg/kg)、低剂量(40mg/kg)组对小鼠耳廓肿胀抑制率分别为38.01%、48.37%、20.22%。中药方“蒲和饮”也能显著降低10%鲜鸡蛋清致足趾肿胀模型小鼠的足趾肿胀率,与模型组比较差异极显著(P<0.01),其“蒲和饮”高、中、低剂量组在注射蛋清后4h的肿胀抑制率均达到最高,分别为44.51%、57.38%、32.39%。结果提示,中药方“蒲和饮”对二甲苯和鲜鸡蛋清所致的炎症具有显著的抑制作用。2小鼠脓毒症模型的建立及中药方”蒲和饮”对小鼠脓毒症的干预效果通过腹腔注射LPS建立小鼠脓毒症模型,进行“蒲和饮”的干预试验研究。试验设立对照组、模型组和药物干预组。观察造模后6-72h不同时间点小鼠的临床症状为：造模6h后小鼠开始出现精神沉郁、被毛凌乱、行动迟缓、呼吸加快等：剖检发现小鼠皮下充血、出血,肠出血,肝脏色泽苍白、部分可见白色点状坏死等。使用中药“蒲和饮”干预后,LPS脓毒症小鼠的临床症状和剖检症状较模型组显著减轻。病理组织学分析表明,造模12h后,可见小鼠肝细胞出现明显变性肿胀,细胞边界及细胞核模糊不清或消失,炎性细胞浸润,肝细胞脂肪样变性,可见凋亡细胞,肝窦明显淤血,48h后,病变情况开始逐渐减轻,72h可见较多双核肝细胞；使用“蒲和饮”干预后的,其肝小叶结构较清楚,肝细胞排列稍微紊乱,少数肝细胞发生轻度变性水肿,少量炎性细胞浸润,中央静脉少许扩张有淤血,余未见异常变化。表明中药方“蒲和饮”对小鼠LPS脓毒症具有一定的干预效果。3“蒲和饮”对LPS脓毒症小鼠肝组织中TLR4及下游相关信号分子mRNA表达量的影响分子固有免疫的研究证明,TLR4为LPS的主要模式识别受体,可通过TLR4/MyD88/NF-κB信号途径引起机体的免疫反应作用。本试验通过分析TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中各重要节点分子表达量的变化,初步确定“蒲和饮”发挥抗炎作用的固有免疫机制并判定该方剂的作用靶标。荧光定量RT-PCR方法检测小鼠肝组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10和HMGB1mRNA表达水平的结果显示：LPS脓毒症造模后,LPS脓毒症小鼠与阴性对照组比较,TLR4、MyD88、NF-κB等基因mRNA表达水平均不同程度升高,分别于18、18、18、12、24、24h达峰值,与阴性对照组的差异极显著(P<0.01)。在使用“蒲和饮”干预后的12、18、24、24、24h时间段,“蒲和饮”干预脓毒症模型小鼠肝组织中LR4、MyD88、NF-κB、 TNF-α、HMGB1mRNA表达水平均显著低于脓毒症模型组小鼠(P<0.05或P<0.01),IL-10的表达水平均高于模型组小鼠,36h与模型组比较差异显著(P<0.05)。研究表明,“蒲和饮”可能是通过TLR4/MyD88/NF-KB信号通路,抑制LPS受体TLR4、及信号转导分子MyD88、转录因子NF-κB、促炎细胞因子TNF-a及晚期炎症介质HMGB1表达,促进抗炎细胞因子IL-10的表达,达到抑制炎症反应。提示TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中MyD88、NF-κB等各节点分子可作为抗炎中药“蒲和饮”的作用靶标。4“蒲和饮”对LPS脓毒症小鼠血清TNF-a、IL-10、PGE2、HMGB1含量的影响在研究中药方“蒲和饮”影响TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中重要节点分子mRNA在组织中表达情况的同时,本试验采用双抗体夹心ELISA方法检测了不同时间点小鼠的血清中TNF-α、IL-10、PGE2、HMGB1等重要相关因子蛋白的表达水平。结果显示,LPS脓毒症模型小鼠血清中TNF-α、IL-10、PGE2及HMGB1浓度高于阴性对照组,分别于12h、24h、8h、24h达峰值。以“蒲和饮”对脓毒症模型小鼠干预治疗,“蒲和饮”干预组小鼠血清中TNF-α含量在12h、24h显著低于脓毒症模型组(P<0.05),IL-10水平在18h、48h显著高于脓毒症模型组(P<0.05,P<0.01),PGE2含量在18h、24h、36h显著低于脓毒症模型组(P<0.01,P<0.05),HMGB1水平在24h极显著低于脓毒症模型组(P<0.01)。研究表明,“蒲和饮”可显著抑制LPS脓毒症模型小鼠血清中TNF-α、PGE2、HMGB1的合成与释放,促进IL-10的合成与释放。提示“蒲和饮”可通过调节外周血中TNF-α、IL-10、PGE2和HMGB1等重要相关因子蛋白合成与释放来发挥抗炎作用,且外周血中TNF-α、IL-10、HMGB1等重要相关因子蛋白含量的变化与组织中TNF-α、IL-10、HMGB1等相应因子mRNA表达的变化相一致。