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目的：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性炎症性自身免疫性疾病，基本病理改变主要是外周关节滑膜慢性炎症及软骨和骨质的破坏。大量研究表明，RA的发病与初始T辅助细胞（naive CD4+T cell，Th0）细胞亚群分化有密切联系，随着研究的深入，人们发现naiveCD4+T细胞另外两种亚型Th17和调节性T细胞（Treg）细胞在RA免疫应答失衡及炎症反应中发挥着重要作用。
白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）是花生四烯酸经5-脂氧合酶（5-LO）代谢的炎症介质，具有很强的趋化作用和炎症调节作用。在RA患者的滑液中，LTB4的含量明显升高。LTB4受体阻断剂或敲除LTB4受体的小鼠，均可阻止关节炎症的发生。可见LTB4是RA发病过程中的重要炎性介质。LTB4是否可影响naiveCD4+Tcell向Treg和Th17方向分化，国内外文献尚未有报道。本研究通过观察LTB4对C57BL/6小鼠脾细胞naive CD4+T cell向Treg和Th17细胞分化的调节作用；并且在CIA小鼠体外实验观察LTB4对Treg与Th17细胞的影响；以期进一步揭示LTB4在类风湿关节炎发病过程中的免疫调节作用。
1 LTB4对Treg/Th17细胞分化的调节
方法：
（1）磁珠分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD62L+naive T细胞。收集分选后细胞，种于预先anti-CD3ε包被的24孔板，加入anti-CD28、TGF-β1及IL-6，体外诱导CD4+CD62L+naive T细胞向Th17方向分化；种于预先anti-CD3ε包被的24孔板，加入anti-CD28及TGF-β1，体外诱导CD4+CD62L+naive T细胞向Treg方向分化；并观察转录因子RORγt及Foxp3时间依赖性表达。
（2）LTB4对naive CD4+T cell向Th17细胞定向分化的影响。分为四组：对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育72小时，收集细胞上清，酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测IL-17。孵育48小时，荧光定量PCR技术检测RORγt的mRNA的表达。
（3）LTB4对naive CD4+T cell向Treg细胞定向分化的影响。细胞孵育72小时流式细胞术观察CD4+CD25+Foxp3+细胞数量，分为五组：同型对照组；对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育36小时荧光定量PCR技术检测Foxp3的mRNA的表达，分为四组：对照组（control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。
结果：数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS11.5统计分析软件进行统计学分析。各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA），用最小显著差法（least significant difference，LSD）作两两比较，P<0.05为有显著性差异。
（1）经磁珠分选后，经流式细胞仪鉴定CD4+CD62L+naive T细胞纯度在90％以上。在抗CD3/CD28存在的条件下，TGF-β1作用3d后可使（10.8667±0.9504）％细胞分化为Treg细胞；在抗CD3/CD28存在的条件下，TGF-β1和IL-6作用3d后IL-17含量（677.8875±87.7284）较对照组明显升高（P<0.01），表明诱导成功。转录因子Foxp3与RORγt mRNA的表达分别在36h及48h达到高峰。
（2）LTB4对naive CD4+T cell向Th17细胞定向分化的影响。应用ELISA法在诱导72h时检测细胞上清IL-17含量，发现LTB4能剂量依赖性升高IL-17的含量，其中LTB4（0.1、1μM）组（865.4775±88.3310、952.9575±71.7512）较对照组（677.8875±87.7284）明显增加（P<0.01）。LTB4在naive T细胞向Th17细胞诱导分化48h时剂量依赖性促进了RORγtmRNA的表达，LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）三个剂量组（1.1933±0.0321、1.4260±0.0661、1.5180±0.0530）均较对照组（1.0000±0.0000）明显升高（P<0.01）。
（3）LTB4对naive CD4+T cell向Treg细胞定向分化的影响。应用流式细胞术检测CD25+Foxp3+细胞数量，发现LTB4在诱导72h时（0.01、0.1、1μM）能剂量依赖性降低CD25+Foxp3+细胞数量，LTB4三个剂量组（8.2600±1.1918、6.0330±0.6503、4.1767+1.8029）均较对照组（10.8667±0.9504）明显减少（P<0.05）。LTB4在naive T细胞向Treg细胞诱导分化36h时剂量依赖性抑制了Foxp3 mRNA的表达，其中LTB4（0.1、1μM）组（0.4700±0.0436、0.2000±0.0361）较对照组（1.0000±0.0000）明显降低（P<0.01）。
上述结果显示LTB4促进Th0向Th17细胞分化，抑制Th0向Treg细胞分化。
2 LTB4对CIA小鼠Treg/Th17细胞的调节作用
方法：
（1）建立CIA模型，造模35天对模型足爪关节评分、观察关节组织病理学改变及CIA模型DBA/1小鼠脾细胞中Th17与Treg细胞的变化。
（2）第28天分离小鼠脾细胞，体外培养加入CⅡ共同孵育，观察关键转录因子RORγt及Foxp3时间依赖性表达。
（3）第28天分离CIA模型DBA/1小鼠脾细胞，加入CⅡ与不同浓度LTB4共同孵育，体外实验观察LTB4对Th17细胞的影响。分为四组：对照组（Control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育72h，收集细胞上清，酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测IL-17细胞因子。孵育36h，荧光定量PCR技术检测RORγt的mRNA的表达。
（4）第28天分离CIA模型DBA/1小鼠脾细胞，加入CⅡ与不同浓度LTB4共同孵育，体外实验观察LTB4对Treg细胞的影响。细胞孵育72h流式观察CD4+CD25+Foxp3+细胞数量，分为五组：同型对照组；对照组（Control组）；LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。孵育36h荧光定量PCR技术检测Foxp3的mRNA的表达，分为四组：对照组（Control组）、LTB4（0.01μM、0.1μM、1μM）组。
结果：统计学分析同前。
（1）CIA模型第35天左右小鼠踝关节红肿及关节强直等典型症状达到高峰。组织病理切片：软骨损伤，滑膜及周围组织增生，大量的炎性细胞浸润。
CIA小鼠第35天脾细胞中Th17与Treg细胞的变化。应用ELISA法检测血清IL-17含量，发现造模组（19.8484±2.5034）较对照组（12.1212±3.9190）IL-17含量增加（P<0.05）。荧光定量PCR检测RORγt mRNA的表达，造模组（2.0489±0.1637）较对照组（1.0000±0.0000）升高（P0.01）。应用流式细胞双标记术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞数量，发现造模组（0.3266±0.0115）较对照组（0.4605±0.0275）细胞数量明显减少（P<0.01）。荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达，造模组（0.4353±0.1267）较对照组（1.0000±0.0000）明显降低（P<0.01）。
（2）第28天分离小鼠脾细胞，体外培养加入CⅡ共同孵育，观察Th17和Treg细胞关键转录因子RORγt和Foxp3mRNA的表达均在36h达到高峰。
（3）体外实验LTB4对CIA模型DBA/1小鼠脾细胞中Th17细胞表达的影响。应用ELISA法检测细胞IL-17含量，发现LTB4能剂量依赖性增加IL-17含量，其中LTB4（0.1μM、1μM）组（10.6033±3.1954、30.7567±6.0536）较对照组（3.4767±2.5080）明显增加（P<0.01）。LTB4剂量依赖性促进了RORγt mRNA的表达，LTB4三个剂量组（1.3713±0.1352、1.4563±0.1301、1.5773±0.1532）均较对照组（1.0000±0.0000）明显升高（P<0.01）。
上述结果显示LTB4对CIA小鼠脾细胞促进Th17细胞分化，抑制Treg细胞分化。
结论：
（1）通过磁珠分选C57BL/6小鼠脾细胞CD4+CD62+naiveT细胞，成功诱导其向Treg和Th17细胞方向分化。并证实LTB4可以促进CD4+CD62+naive T向Th17细胞的分化，并抑制向Treg分化，呈剂量依赖性。
（2）成功建立CIA模型，体外实验证实LTB4可以促进CIA模型小鼠脾细胞Th17细胞的分化，抑制Treg细胞的分化，呈剂量依赖性。