目的:胰腺癌是一种致死率很高的恶性肿瘤,预后差,在世界范围内日益成为一种沉重的健康负担。虽然手术、化疗和放射治疗可以轻微缓解胰腺癌患者的症状,但由于缺乏有效的分子生物标记物实现早期发现和预测预后,胰腺癌病人临床治疗效果仍不理想。因此,寻找新的潜在的胰腺癌治疗靶点已迫在眉睫。研究发现PD-L1在临床预后差的胰腺癌患者中过度表达。PD-L1作为T细胞活化的负调控分子,通过改变免疫监视状态促进肿瘤进展。最近,程序性死亡配体-1（PD-L1）作为一种免疫检查点,已开始应用于肿瘤治疗。众所周知,miRs可以控制多个靶基因的表达,从而调节各种生物过程和免疫监视。值得注意的是,一些microRNAs（miRs）已被证实下调PD-L1从而提高靶向治疗的疗效。miR-195-5p被发现与多种人类癌症有关,且miR-195在胰腺癌中的抑瘤作用已经在以往的研究中被报道。竞争性内源性RNA（ceRNAs）被认为是通过降低miRs的靶向浓度来进行相互通信的RNA转录物。长链非编码RNA（lncRNAs）作为ceRNAs可以调节癌症进展。目前,一系列lncRNAs已被证实在胰腺癌肿瘤形成中起重要作用。LINC00473在肾母细胞瘤组织中过度表达,抑制了miR-195在发病机制中的抑癌作用。我们在线预测发现miR-195-5p与LINC00473及PD-L1均存在结合位点。综上所述,我们推测LINC00473可能通过结合miR-195-5p调节PD-L1表达,促进胰腺癌发生和发展。本研究旨在证实这一假说,为进一步分析胰腺癌进展的分子机制提供一定的理论基础。研究方法:1.临床资料:选取从2008年12月至2012年1月,在中国医科大学附属盛京医院胰腺和胆道外科接受胰腺切除术的134例胰腺癌患者的胰腺癌组织。对这些病人随访36个月,随访截至时间为2014年12月,采用Kaplan-Meier法进行生存期分析。另外,收集20名胰腺良性囊肿患者的正常胰腺组织,液氮保存做后续分析。本研究符合中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准的指导原则。2.免疫组化方法检测PD-L1蛋白在胰腺癌和正常胰腺组织中的表达情况。3.利用RT-qPCR法检测PD-L1、LINC00473及miR-195-5p在胰腺癌组织中的表达。4.利用RT-qPCR法检测LINC00473在5种胰腺癌细胞株中表达,筛选出1株表达量最高的细胞株用于后续实验。5.双荧光素酶报告基因检测mi R-195-5p与PD-L1及LINC00473的结合情况。6.FISH检测LINC00473的细胞定位。7.RNA免疫共沉淀和RNA下拉实验检测miR-195-5p与LINC00473的结合情况。8.构建miR-195-5p模拟物及抑制物、LINC00473过表达质粒及沉默质粒及相应对照组转染SW-1990细胞。9.分别用EDU细胞增殖检测、Tunel细胞凋亡检测、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭情况。10.用RT-qPCR及Western blot方法检测各组细胞Bcl-2,Bax,MMP-2及MMP-9表达情况。11.将SW-1990细胞与CD8+T细胞共培养,ELISA法检测各组细胞的细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4表达量。12.Annexin V-FITC/PI双染法检测各组CD8+T细胞凋亡。13.用RT-qPCR及Western blot方法检测各组细胞PD-1及PD-L1表达情况。结果:1.免疫组化染色结果显示,PD-L1主要表达在细胞膜,PD-L1在胰腺癌组织中阳性表达率为57.69%,明显高于正常胰腺组织（23.53%）。PD-L1高表达与肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移密切相关（P<0.05）。Kaplan-Meier分析显示PD-L1阳性表达组的胰腺癌患者整体生存较差。2.与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中LINC00473、PD-L1表达显著升高,miR-195-5p表达显著降低（P<0.05）。与人正常胰腺细胞H6C7相比,胰腺癌细胞SW-1990、Panc-1、Bx PC-3、AsPC-1、CAPAN-2中LINC00473表达均显著升高,我们选择LINC00473表达水平最高的SW-1990细胞株开展后续实验。3.双荧光素酶报告基因检测结果显示,与阴性对照组相比,miR-195-5p与PD-L1野生型质粒共转染组荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,而突变型质粒荧光素酶活性强度无明显变化。说明miR-195-5p与PD-L1存在靶向调节关系。分组实验中miR-195-5p mimic组miR-195-5p表达量显著升高,miR-195-5p inhibitor+Atezolizumab（PD-L1抑制剂）组miR-195-5p表达量显著降低。miR-195-5p mimic组和Atezolizumab组PD-L1表达量显著降低。结果表明,miR-195-5p可靶向下调PD-L1表达。4.荧光原位杂交试验表明LINC00473主要定位于细胞质。5.双荧光素酶报告基因检测结果显示,与阴性对照组相比,野生型LINC00473质粒与miR-195-5p共转染组荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,而突变型质粒荧光素酶活性强度无明显变化,说明miR-195-5p与LINC00473存在靶向调节关系。RNA pull down结果显示,与MUT-mi R-195-5p和Bio-NC组相比,WT-miR-195-5p结合的LINC00473明显增加,RIP实验进一步证实LINC00473可以与miR-195-5p结合。在LINC00473沉默和过表达的分组实验中,si-LINC00473组细胞miR-195-5p表达显著升高,PD-L1表达量显著降低,miR-195-5p inhibitor组miR-195-5p表达显著降低,PD-L1表达量显著升高（P<0.05）。表明LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p,从而上调PD-L1表达。6.分组功能实验中显示与Blank组相比,miR-195-5p mimic组和Atezolizumab组SW-1990细胞增殖情况显著降低,凋亡情况显著升高,Bcl-2基因表达量显著降低,Bax表达量显著升高（P<0.05）。划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示,与Blank组相比,mi R-195-5p mimic组和Atezolizumab组细胞迁移和侵袭情况显著降低,MMP-2、MMP-9表达量显著降低（P<0.05）。结果表明,过表达miR-195-5p或抑制PD-L1可促进胰腺癌细胞凋亡,抑制增殖、迁移和侵袭。7.沉默LINC00473和过表达LINC00473分组功能实验结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞增殖情况显著降低,凋亡情况显著升高,Bcl-2基因表达量显著降低,Bax表达量显著升高。LINC00473组细胞增殖情况显著升高,细胞凋亡情况显著降低,Bcl-2基因表达量显著升高,Bax表达量显著降低（P<0.05）。划痕实验和Transwell侵袭实验检测显示,与Blank组相比,si-LINC00473组细胞迁移和侵袭情况显著降低,MMP-2、MMP-9表达量显著降低,LINC00473组细胞迁移和侵袭情况显著升高,MMP-2、MMP-9表达量显著升高（P<0.05）。结果表明,沉默LINC00473可促进胰腺癌细胞凋亡,抑制增殖、迁移和侵袭。8.将各组SW-1990细胞和CD8+T细胞的共培养后进行以下实验。ELISA结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞促肿瘤细胞因子IL-10表达量显著降低,抗肿瘤细胞因子IFN-γ、IL-4表达量显著升高;LINC00473组细胞促肿瘤细胞因子IL-10表达量显著升高,抗肿瘤细胞因子IFN-γ、IL-4表达量显著降低（P<0.05）。流式细胞仪检测凋亡结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组CD8+T细胞凋亡情况显著降低,LINC00473组CD8+T细胞凋亡情况显著升高（P<0.05）。RT-qPCR和Western-blot结果显示,与Blank相比,si-LINC00473组细胞PD-L1、PD-1表达情况显著降低,LINC00473组细胞PD-L1、PD-1表达情况显著升高（P<0.05）。结果表明:LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达影响CD8+T细胞活化。结论:1.高水平的PD-L1表达与胰腺癌患者不良预后显著相关。与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中LINC00473、PD-L1表达量增高,mi R-195-5p表达量降低。2.LINC00473作为ceRNA通过竞争性结合miR-195-5p上调PD-L1表达。3.胰腺癌中miR-195-5p靶向抑制PD-L1的表达,抑制胰腺癌进展。4.LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达进而促进胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,抑制胰腺癌细胞凋亡,可以加速胰腺癌进展。5.LINC00473作为ceRNA结合miR-195-5p上调PD-L1的表达,从而抑制CD8+T细胞活化。