论文部分内容阅读
芳香族化合物是环境污染物中主要的一类污染物，它们能在高等生物和人体内富集，从而造成伤害。但是由于芳香族化合物结构比较稳定，很难利用物理、化学方法除去。目前已经发现很多微生物可以以苯酚为唯一碳源和能源生长，这给我们提供了一个有效降解苯酚的方式——微生物降解。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)对多种芳香族化合物具有非常高的降解活性，根据序列比对和同源性分析，ncgl2588基因被认为是编码苯酚羟化酶的基因，但目前并未见关于其功能研究方面的报道。本研究利用基因敲除技术和克隆技术证实了ncgl2588基因的功能，并对其酶学性质做了详细的测定。主要研究内容如下：1.利用重叠PCR技术构建了敲除质粒pK18mobsacB-Δ2588，并通过同源重组原理成功的将谷氨酸棒状杆菌中的ncgl2588基因敲除。通过比较其对苯酚的降解，我们发现缺失突变株丧失了以苯酚为碳源和能源生长的能力，表明ncgl2588基因是谷氨酸棒状杆菌降解苯酚所不可缺少的。2.构建了原核表达质粒pET28a-ncgl2588，并由表达宿主BL21（DE3）成功表达了一条大小为73kDa的可溶蛋白，与理论分析的结果一致，经蛋白纯化后测定酶活，此蛋白对苯酚具有很高的降解活性，测得活性为：0.3mmol·min-1·mg-1；这个结果有力得证实了ncgl2588的功能。3.为了研究此蛋白的酶学特性，我们对表达的苯酚羟化酶进行了一系列的酶学性质测定，包括最适温度，最适pH值，Km值，底物范围等。得出以下结果：3.1苯酚羟化酶的最适pH和最适温度分别为pH8.0和45°C；苯酚羟化酶对底物苯酚和NADPH的Km值分别为Km(Phenol)=256μM和Km(NADPH)=284μM；并且此蛋白对苯酚的底物亲和力非常高，其它芳香族化合物除了间苯二酚和对苯二酚外的底物亲和力却只有苯酚的10%-30%。3.2苯酚羟化酶对低温非常敏感，在-20°C和-80°C下放置24小时候便损失了50%和80%的活性，只有在4°C下能维持两周内活性基本不变。3.3金属离子Fe2+,Fe3+,Zn2+和Ni2+会严重抑制苯酚羟化酶的活性，使其基本丧失酶活；Mn2+和Mg2+的存在下能小幅度提高酶活；Co2+和Cu2+同样能抑制其活性，在它们的存在下苯酚羟化酶的活性只有50%左右。3.4根据序列比对及生物信息学分析，认为P241, P261, R262, C349, C476为酶活的关键位点）,我们构建了P241S, P261S, R262S, C349S和C476S等定点突变体，其中C349和C476被突变后只保持了野生型苯酚羟化酶活性的50%，P261被突变后活性为野生型的15%，预示着这三个氨基酸位点为苯酚羟化酶的保守位点；而突变体P241S和R262S却大幅度的提升了酶活，分别提升了2倍和4倍，显著地改善了苯酚羟化酶的活性。