由创伤、烧伤和各种疾病导致的难以愈合的创面常常伴随创面感染,从而导致创面愈合延迟。创面难以愈合的最主要原因包括创面局部感染和局部生长因子数量减少。富血小板血浆(PRP)中富含大量的多种生长因子,这些生长因子共同作用从而促进软组织修复。然而将PRP单独应用于损伤部位几乎不会得到显著的改善,分析原因与其所含生长因子的短寿命和过早失活有关。另外,PRP抗菌能力有限。本研究的目的是探讨壳聚糖-丝素蛋白保湿敷料作为PRP的理想载体的可能性,从而提高PRP的稳定性,维持生长因子的活性并持续释放作用于创面。本研究中将添加有纳米银(AgNPs)的壳聚糖-丝素蛋白混合液乳化并经真空冷冻干燥成支架,并在支架材料一面形成不对称涂层。使用二次冻干技术将PRP加载到复合支架上以制备组织工程敷料。使用透射电子显微镜表征AgNPs。使用扫描电子显微镜观察复合敷料的拓扑结构。通过电感耦合等离子体质谱法测定敷料的银含量。通过静态水接触角实验证明复合敷料的不对称润湿性。通过测量物理和机械性能,观察到敷料相对高的孔隙率,有利的保湿能力和合适的拉伸强度。通过体外抗菌效果分析,观察到敷料材料对各种细菌的抗菌性能和微生物隔绝性能。使用BCA测定法测定总蛋白质缓释性能。体外细胞毒实验和体内致敏性实验均检测到良好的生物相容性。此外,在小鼠感染性创面模型中分析复合敷料治疗下创面的愈合效率。对创面愈合率、创周渗出液细菌培养、全血细胞分析和组织学检查等数据的分析均得到了令人满意的结果。本研究所述材料有望成为理想抗菌促愈保湿敷料之一,并用于临床难愈性感染创面的治疗。第一部分负载富血小板血浆的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的制备及其表征目的:探讨合成负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料,观察其横断面拓扑结构,初步评估敷料应用于皮肤创面修复的可行性。方法:将AgNPs加入壳聚糖-丝素蛋白共混乳液中,经过冷冻干燥形成疏松多孔的海绵样敷料支架,在敷料材料的光滑面形成不对称润湿涂层。最后使用二次冻干技术将PRP加载到复合支架上以制备组织工程敷料(CTS-SF/Ag/SA/PRP)。透射电镜下观察纳米银颗粒,扫描电子显微镜下观察复合敷料横断表面的拓扑结构,ICP-MS检测复合敷料中的Ag元素含量。结果:成功制备了粒径相对均一且颗粒分散性较好的AgNPs。成功制备了兔来源的PRP;成功制备了负载PRP的非对称润湿改性壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料(CTS-SF/Ag/SA/PRP),未改性面布满微孔,整体呈漫反射,改性面相对光滑平整,并伴轻微反光。透射电镜下观察制备得到的AgNPs粒径均一,扫描电子显微镜下观察CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料横断表面具有相互贯通的孔道结构,孔径约30-100μm,孔道表面相对粗糙,并可见纳米银颗粒附着于孔道壁上。用ICP-MS检测CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料中的Ag元素含量为9.0998±0.1337μg/g,与Acosin纳米银医用抗菌敷料中Ag元素含量相当(9.7599±0.3131ug/g)。结论:1)成功制备了颗粒分散性较好且颗粒粒径较为均一的AgNPs;2)成功制备了兔来源的PRP;3)成功制备了负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银非对称润湿改性抗菌保湿敷料(CTS-SF/Ag/SA/PRP)。第二部分 负载富血小板血浆的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的物理化学性能及抗菌性检测目的:通过测试负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的理化性能、机械性能、抗菌性能和蛋白缓释性能,进一步为材料作为创面敷料提供证据。方法:检测负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的孔隙率、溶胀度、保湿时间、拉伸强度和非对称改性情况,测定负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的抗菌性能、微生物隔绝性能和总蛋白缓释性能。结果:滴墨实验和静态水接触角检测显示CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料的非对称性。CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料的孔隙率和溶胀度均较高,非对称改性保障了敷料具有近20h的保湿时间。CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料的拉伸强度能够使材料胜任创面护理的工作。CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌均存在良好的杀伤效果,其改性面能够有效阻隔外界细菌的入侵,具有良好的微生物屏障作用。BCA检测结果显示CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料能够将其中包含的蛋白缓慢释放,从而持续作用于创面。结论:1)负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的非对称改性未对材料的孔隙率产生明显影响,改性面的存在使得敷料的保湿性能及对外界微生物的阻隔作用均有了显著提高,60.41%±1.20%的孔隙率有利于创面渗出液的吸收及创面组织的物质交换及新陈代谢,同时近20小时的保湿时间也有助于保护创面在湿润状态下愈合;2)尽管纳米银的添加使得负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料的拉伸强度轻微降低到接近0.40MPa,但其仍然能够胜任护理创面的任务。而PRP的负载和硬脂酸的非对称改性对敷料的拉伸强度几乎没有影响;3)负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均表现出了相对满意的杀伤效果;4)负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料可以缓速且持续地将蛋白质释放到创面中,其中含有的促进软组织修复的各种生长因子将持续作用于创面从而促进创面愈合。第三部分负载富血小板血浆的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料对不同细胞增殖的影响及其生物安全性评价目的:检测负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料对细胞增殖的影响,同时检测其生物安全性,为进一步的体内实验提供证据支撑。方法:选择L929细胞和人真皮成纤维细胞对CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料浸提液的细胞毒性进行分析,通过豚鼠皮下致敏反应评估材料的生物安全性。结果:成功分离培养了人真皮成纤维细胞,细胞贴壁生长,有序排列成栅栏状或漩涡状,细胞形态清晰,呈梭形或多边形,胞质向外伸出伪足。总的增值曲线呈“S”型。CTS-SF/Ag/SA/PRP浸提液培养下的L929、人真皮成纤维细胞活性高于对照组。豚鼠皮下致敏实验显示CTS-SF/Ag/SA/PRP浸提液未致过敏反应。综合分析细胞毒实验和致敏性实验结果,CTS-SF/Ag/SA/PRP具有良好的生物安全性。结论:1)成功提取、分离、培养得到人真皮成纤维细胞;2)负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料浸提液能够促进人真皮成纤维细胞和L929细胞的增殖;3)负载PRP的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料浸提液对豚鼠皮下未见明显刺激现象,生物相容性较好。第四部分负载富血小板血浆的壳聚糖/丝素蛋白纳米银抗菌保湿敷料对感染性创面修复的体内评价目的:建立小鼠背部皮肤感染性创面模型,通过体内实验分析CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料治疗下的创面愈合情况,为材料作为创面敷料提供进一步的证据支撑。方法:建立小鼠背部皮肤感染性创面模型,采用CTS-SF/Ag/SA/PRP、CTS-SF/Ag/SA、Acosin、Gauze-PRP和Gauze五种敷料治疗创面。分别对创面愈合率、创面渗出物细菌培养、全血细胞分析、组织学分析和术后12天脏器银含量进行分析,全面评估CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料对感染性创面的治疗效果。结果:术后12天的创面愈合率分析显示CTS-SF/Ag/SA/PRP最佳(98.40±0.8%),CTS-SF/Ag/SA 次之(93.44±2.1%),Acosin 居中(84.26±1.9%),Gauze-PRP(76.28±4.4%)和 Gauze(74.14±2.1%)较差且无统计学差异。术后第三天创面渗出物细菌培养后显示,CTS-SF/Ag/SA/PRP、CTS-SF/Ag/SA和Acosin治疗组培养基未见菌落形成,而Gauze-PRP和Gauze治疗组培养基长出菌落。对小鼠全血进行血细胞分析,比较分析不同时间点组内及组间白细胞计数、中性粒细胞百分比和淋巴细胞百分比,得到CTS-SF/Ag/SA/PRP组有效杀灭创面的铜绿假单胞菌,缩短由于创面感染所导致的伤口愈合的防御/炎症阶段,并能够一定程度上调节机体的免疫反应。术后第7天HE染色组织切片显示,CTS-SF/Ag/SA/PRP和CTS-SF/Ag/SA两组的表现为炎症较轻,没有坏死,亦没有炎性渗出,增生的肉芽组织中有散在的炎性细胞浸润,表面已有再上皮化的薄层上皮爬入,但此时基底层还不太明显。术后第12天时的HE染色组织切片显示,CTS-SF/Ag/SA/PRP组创面愈合良好,覆盖薄层上皮,真皮层新生血管丰富,同时散在的浸润有中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞,表明免疫反应较好。与之相比较CTS-SF/Ag/SA组创面还未完全被新生的薄层上皮所覆盖。可以看出CTS-SF/Ag/SA/PRP组创面在第12天已基本完成修复和改建。术后12天Masson染色结果与HE染色结果基本吻合,CTS-SF/Ag/SA/PRP和CTS-SF/Ag/SA两组中伤口处的胶原蛋白沉积更密集且规则,其中CTS-SF/Ag/SA/PRP组创面组织真皮层呈现出最规则且密集的胶原蛋白。术后第12天ICP-MS检测小鼠脏器的银含量显示,银沉积主要集中在小鼠肝脏,CTS-SF/Ag/SA/PRP组小鼠的脏器银含量沉积较CTS-SF/Ag/SA组和Acosin组小。结论:4)成功建立了小鼠背部皮肤的感染性创面动物模型;5)CTS-SF/Ag/SA/PRP复合敷料能够有效控制感染性创面的感染程度、显著降低炎症反应并促进创面修复进程,提高创面修复质量。