肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率在世界范围内分别位于第六位和第三位,且近年来其发病率有逐渐上升的趋势。HCC的发病机制复杂,肿瘤相关基因异常,如抑癌基因的甲基化、癌基因的过度激活,是HCC发生的重要因素。HCC进展迅速,对常规的化疗和放疗均不敏感,手术切除和局部消融治疗仅对早期肿瘤有效,因此,寻找新的治疗HCC的有效策略迫在眉睫。近年来,分子靶向治疗逐渐成为HCC治疗的研究热点。多激酶抑制剂索拉非尼是第一个用来治疗HCC的分子靶向药物,它能够有效改善晚期HCC患者的预后,证明了分子治疗在HCC中的重要性。建立有效的分子治疗方案关键在于阐明肝癌的发生机制,鉴定肿瘤发生的关键靶点。因此,深入研究HCC发病的分子机制,寻找能有效阻断HCC发生发展的新靶点具有重要意义。TIPE1(tumor necrosis factor alpha-induced protein8-like1,TNFAIP8L1)是在2008年被发现的一个新基因,属于TEPE (tumor necrosis factor alpha-induced protein8, TNFAIP8)家族。该家族共有4个成员,TIPE、TIPE1、TIPE2与TIPE3,各成员间具有较高的同源性。人TIPE1与TIPE、TIPE2和TIPE3之间的同源性分别为57%、57%和55%,而人TIPE1与鼠TIPE1之间的同源性为82%。除TIPE外,该家族的其他成员都发现较晚,但已有研究表明,TIPE和TIPE2在肿瘤发生和免疫调控中发挥非常重要的作用。因此,深入研究TIPE家族另外两个成员的功能及其与疾病之间的关系显得十分必要。TIPE1是最晚被发现的TIPE家族成员,迄今为止只有三篇文献。2008年Cell首次报道了TIPE1与细胞死亡间的重要关系。作者利用全基因组siRNA筛选能够调控坏死性凋亡的基因时发现,干扰TIPE1的表达可分别抑制凋亡和坏死性凋亡,提示其可能同时参与这两种细胞死亡的调控,是重要的细胞死亡调控蛋白。Cui等报道了TIPE1在小鼠组织中的表达谱,发现TIPE1在小鼠体内分布广泛,除成熟的T、B淋巴细胞外各组织中均能检测到其表达。此外,Wilson等利用基因芯片分析发现TIPE1可能与糖尿病引发的心脏代偿失调有关。然而,TIPE1在人体不同组织中的表达特点、其与疾病发生之间的关系以及是否参与细胞死亡的调控,迄今尚未见报道。本课题前期研究发现,TIPE1在人体组织中分布广泛,特别是在肝脏中表达较高,且与癌旁组织对比,肝细胞肝癌中的TIPE1表达显著下降,提示TIPE1可能与肝细胞肝癌的发生有关。在此基础上,本课题拟进一步研究TIPE1在人体内的表达分布和生物学功能,并对其在肝细胞肝癌发生中的作用及机制进行初步探讨。一、TIPE1在人体组织中的表达谱研究TIPE1在人体组织中的分布迄今尚未明确,本研究利用实时荧光定量RT-PCR.免疫组化及免疫荧光技术检测了人胚胎组织及成体组织细胞中的表达。1.TIPE1mRNA在人胚胎及正常成体组织中的分布:本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测正常人及胚胎不同组织cDNA中的TIPE1mRNA的表达。结果表明,TIPE1在正常人体组织中分布广泛,大部分组织器官均有表达,其中肝脏的表达较高；但TIPE1在胚胎中只有大脑高表达。2.TIPE1蛋白在正常人成体组织器官中的表达：为进一步研究TIPE1在成体组织中的分布,本研究利用TIPE1抗体通过免疫组化技术检测正常人不同组织器官中TIPE1蛋白的表达。免疫组化结果显示,多种正常人组织器官中均能检测到TIPE1的蛋白表达,其中气管的软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、胃的主细胞和壁细胞、膀胱的移行上皮、骨骼肌细胞和动脉管壁中的平滑肌细胞中TIPE1的蛋白表达水平较高。3.TIPE1在肝细胞中主要表达在细胞浆：根据上述TIPE1的表达谱,选择肝脏作为研究的靶器官。利用免疫荧光技术,用TIPE1抗体检测癌旁来源的肝细胞系QSG7701中的内源性TIPE1表达,结果显示,TIPE1在肝细胞中主要表达在细胞浆。二、TIPE1在肝细胞肝癌中表达明显下调,其表达与肝癌脉管转移负相关,与病理分级和患者预后显著正相关1.与癌旁组织相比,肝细胞肝癌中的TIPE1表达明显下调,且与病理分级显著正相关并和临床转移负相关：收集26例肝细胞肝癌及其对应的癌旁组织标本和6例肝海绵状血管瘤组织,免疫组化检测TIPE1的表达,根据染色强度及染色范围进行免疫组化评分,统计学分析TIPE1表达与临床指标间的相关性。结果表明,肝海绵状血管瘤中的正常肝组织和癌旁组织中可检测到较高水平的TIPE1表达,且二者间无明显差异,而肝癌组织中的TIPE1表达则比其对应癌旁组织明显降低(p<0.001)。为证实上述结果,进一步利用免疫组化检测人肝细胞肝癌组织芯片中TIPE1的表达。与肝癌组织检测结果一致,组织芯片检测显示：肝细胞肝癌中的TIPE1表达比癌旁组织明显下调(p<0.001)；TIPE1的表达与肿瘤的病理分级显著正相关(p<0.001),病理分化程度越低的肝细胞肝癌,其TIPE1表达越低；且TIPE1的表达与肝癌脉管转移(p=0.0191)负相关,提示TIPE1表达越低的肿瘤越容易发生淋巴/静脉转移。2.组织芯片检测发现,TIPE1的表达与肝细胞肝癌患者的预后显著正相关：为进一步明确TIPE1的表达与肝细胞肝癌的相关性,利用免疫组化的方法检测人肝癌生存期组织芯片中TIPE1的表达。生存期分析发现,TIPE1表达阳性的患者,其术后生存时间显著高于TIPE1表达阴性的患者,提示TIPE1的表达与肝细胞肝癌患者的预后显著正相关(p=0.0172)。三、TIPE1能够显著抑制BaIb/c小鼠体内H22肝肿瘤的生长上述临床研究显示TIPE1在肝癌组织中表达明显降低,且TIPE1的表达与肿瘤分化程度、脉管转移及患者生存期显著相关,强烈提示TIPE1可能在肝癌发生中发挥抑癌基因的作用。为进一步验证TIPE1对肝癌细胞的抑制作用,设计利用荷瘤鼠进行体内实验。将小鼠肝癌细胞H22以2×105每只接种于Balb/c小鼠皮下制备荷瘤鼠。当肿瘤直径达到0.5cm时,按肿瘤大小随机分成两组,分别瘤内注射mTIPE1-pRK5和对照pRK5质粒,每4d注射一次,每次20μ g,共4次,并每隔一天测量肿瘤的长径和宽径以计算肿瘤的体积。于最后一次质粒注射后的第4d处死小鼠,剥取肿瘤,拍照并称重。肿瘤的生长曲线及瘤重统计结果表明,TIPE1过表达能够显著抑制Balb/c小鼠体内H22肿瘤的生长(p<0.001)。RT-PCR和免疫组化的结果显示,瘤内注射mTIPE1-pRK5后,H22肿瘤细胞内mTIPE1的表达水平明显升高。四、TIPE1能够显著抑制肝癌细胞生长,并且诱导肝癌细胞死亡临床检测及动物实验均显示TIPE1对肝癌细胞有明显的抑制作用,为深入研究TIPE1的抑癌机制,本课题设计了以下的体外实验：1.TIPE1能够显著抑制肝癌细胞系的生长能力：为进一步验证TIPE1对肝癌细胞的抑制作用,在TIPE1表达相对较低的肝癌细胞系Bel7402、SMMC7721和HepG2细胞中,转染pcTIPE1及其对照质粒pcDNA3.0,转染前及转染后每隔24h用CCK-8测定OD450值,绘制细胞的生长曲线。结果表明,TIPE1过表达可以明显抑制Bel7402、SMMC7721和HepG2细胞生长(p<0.001)。为验证上述结果,选择内源性TIPE1表达较高的HepG2.2.15和QSG7701细胞,脂质体转染TIPE1siRNA (siRNA199、siRNA313和siRNA999)和对照NC,72h后用CCK-8测定细胞活性。结果表明,与过表达实验结果一致,抑制HepG2.2.15和QSG7701细胞中TIPE1的表达可以显著促进细胞生长(p<0.001)2.TIPE1可明显降低肝癌细胞系的克隆形成能力：同上在Be17402、SMMC7721和HepG2细胞中过表达TIPE1,在HepG2.2.15和QSG7701细胞中干扰TIPE1,转染24h后消化细胞,并将消化的细胞以3000/孔接种于6孔板,7-12d后用结晶紫染色,计数细胞的克隆数并进行统计分析。结果表明,过表达TIPE1能够明显降低Bel7402、SMMC7721和HepG2细胞的克隆形成能力(p<0.001),而抑制TIPE1后,HepG2.2.15和QSG7701细胞的克隆数目则明显增加(p<0.001)3.TIPE1能够诱导肝癌细胞的死亡：文献报道,敲除TIPE1可抑制细胞的凋亡和坏死性凋亡,提示TIPE1具有诱导细胞死亡的能力。为验证TIPE1对肝癌细胞死亡的诱导能力,在Be17402细胞中转染pcTIPE1-HA及其对照pcDNA3.0质粒,24h后镜下观察细胞的形态学变化,之后一部分细胞用HA抗体做细胞免疫荧光染色,观察Be17402转染pcTIPE1-HA后的细胞核变化；另一部分细胞消化后分别做台盼蓝染色计数或标记AnnexinV/PI,流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示：Bel7402细胞转染pcTIPE1-HA质粒24h后,细胞明显出现变圆、固缩或膨大；细胞核显示核固缩、核碎裂；台盼蓝染色显示死亡细胞数目明显增加(p=0.0013)；流式细胞术检测显示,pcTIPE1-HA转染组AnnexinV、PI双阳性的细胞数(19.43%±0.92%)比对照组(9.9%±0.7%)明显增多(p=0.0002)。上述结果显示TIPE1能够显著诱导肝癌细胞的死亡。五、TIPE1抑癌机制研究1.TIPE1以caspase和RIP1非依赖方式诱导细胞死亡：为了探讨TIPE1诱导肝癌细胞死亡的机制,本课题设计在肝癌细胞系Be17402中进行阻断实验：利用caspase广谱抑制剂zVAD-fmk以及RIP1抑制剂Nec-1预处理细胞,阻断凋亡／坏死性凋亡通路后再转染pcTIPE1及其对照pcDNA3.0质粒,转染48h后用CCK-8检测活细胞数。结果表明,无论是zVAD-fink、Nec-1单独作用,或者是两者联合作用,都无法逆转TIPE1所诱导的细胞死亡,提示TIPE1介导的肝癌细胞死亡是caspase和RIP1非依赖的。2.TIPE1可与Rac1相互结合,并通过抑制Rac1的活性进而影响其下游的信号通路：遗传分析表明,TIPE家族的4个成员中,TIPE1和TIPE2在遗传关系上更密切,提示二者可能有着相似的分子结合模式。最近有文献报道,TIPE2可通过其氨基端第15、16和24位赖氨酸残基与RaC1结合并抑制其活性。本研究分析发现TIPE1同样具备这3个氨基酸,提示TIPE1可能与Rac1结合并影响其活性。为验证上述假说,分别利用免疫共沉淀及PAK-GST pull-down实验研究TIPE1与Rac1的结合及TIPE1对Rac1活性的影响。结果发现,TIPE1能够与Rac1相互结合,且过表达TIPE1能够明显抑制Rac1的活性。Western blot进一步检测Rac1下游的信号通路分子,结果表明,在TIPE1过表达细胞中,Rac1下游通路分子磷酸化的p65、磷酸化的JNK以及抗凋亡分子Bcl-2的表达均明显降低,提示TIPE1可通过抑制Rac1的活性进而抑制其下游NF-κ.B和JNK信号通路的激活,并可通过降低Bcl-2的水平从而影响线粒体凋亡通路。3.干扰Rac1可逆转TIPE1siRNA的促细胞生长作用：为研究TIPE1是否通过Rac1抑制肝癌细胞的生长,在HepG2.2.15细胞中转染TIPE1siRNA或／和Racl siRNA,72h后用CCK-8测定活细胞数。结果显示,Racl siRNA能够逆转TIPE1siRNA所诱导的细胞生长,即在干扰Rac1之后,下调TIPE1所诱导的细胞生长受到显著抑制,证明TIPE1抑制肝癌细胞生长依赖于其对Rac1的抑制。4.TIPE1能够显著抑制肝癌细胞的迁移能力：众多文献显示,NF-κB和JNK信号通路不仅与细胞死亡有关,而且与细胞迁移和肿瘤转移密切相关。本研究临床资料分析显示,TIPE1的表达可能与肝癌的转移有关。因此,本课题设计进行了细胞迁移实验。在Be17402细胞中分别转染pcTIPE1及其对照质粒pcDNA3.0,转染24h后消化细胞,然后以相同细胞密度分别接种到transwell小室和96孔板中,并立刻在96孔板中加CCK-8测定活细胞数。12h后,transwell小室固定染色的同时再次用CCK-8测定96孔板中的活细胞数。结果表明,在Be17402细胞消化种板12h后,pcTIPE1转染组的肝癌细胞生长尚未受到明显抑制,但其迁移能力却已被显著抑制(p<0.0001)。六、去甲基化药物5-Aza可上调肝癌细胞中TIPE1mRNA的水平,但肝癌及癌旁组织中TIPE1的启动子区域均存在甲基化,二者无显著性差异体内外实验证实,TIPE1能够诱导肝癌细胞的死亡并抑制其生长和迁移,进而在肝癌发生中发挥抑癌基因的作用。众多文献显示,肿瘤细胞中抑癌基因启动子区域的甲基化是其表达降低的最主要原因之一。为研究甲基化是否介导肝癌细胞中TIPE1的低表达,本课题设计了去甲基化实验和临床标本的甲基化检测：1.去甲基化药物5-Aza能够上调肝癌细胞系HepG2中TIPE1mRNA的水平：利用去甲基化药物5-Aza及其对照,对TIPE1表达较低的肝癌细胞系HepG2进行处理,48h后收细胞检测TIPE1mRNA的表达变化。结果表明,5-Aza确实能够上调HepG2中TIPE1mRNA的表达水平。2.肝癌及癌旁组织中均存在TIPE1启动子区域的甲基化,二者无显著性差异：TIPE1在肝癌组织中下调明显,为研究其下调是否由启动子甲基化所造成,首先分析TIPE1的DNA序列并根据MethPrimer网站设计5对甲基化引物,经阳性对照检验,筛选并确定有效的甲基化引物M3/M4,进而设计与M3/M4对应的非甲基化引物。抽提5种肝癌细胞系和26例肝细胞肝癌及其相对应癌旁组织的基因组DNA,用MS-PCR方法检测TIPE1启动子区域甲基化情况。结果表明,所有检测标本中(肝癌细胞系、肝癌及其对应癌旁组织)均存在TIPE1启动子区域的甲基化,但肝癌与癌旁组织间的甲基化无显著性差异,提示DNA甲基化并不是肝癌组织TIPE1低表达的原因,其机制有待于进一步研究。综上所述,本课题通过一系列体内外实验,首次明确了TIPE1在人体组织中的表达谱,并对TIPE1抑制肝癌细胞的作用及其在肝细胞肝癌发生中的分子机制进行了深入研究。本论文是第一篇研究TIPE1和疾病之间关系的文章。本研究表明,TIPE1在人成体组织内分布广泛,但在胚胎中只在大脑高表达。TIPE1通过与Rac1结合并抑制其活性,进而抑制其下游NF-κB和JNK信号通路的活化,从而影响肝癌细胞的生长、死亡和迁移。TIPE1在肝细胞肝癌中表达明显降低,并与病理分级、脉管转移和患者预后显著相关,提示TIPE1的表达降低在肝细胞肝癌的发生中发挥重要作用。去甲基化药物5-Aza可上调肝癌细胞中TIPE1的表达,但在肝癌及癌旁组织中TIPE1的启动子区域均存在甲基化,二者无显著性差异,提示DNA甲基化并不是肝癌组织TIPE1低表达的原因,其机制有待于进一步研究。