肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界第5大常见肿瘤,也是世界范围内癌症相关死亡的第三大主要原因,其发病率/死亡率接近于1.0,每年有近600,000人死亡。目前针对HCC药物治疗和开发上已取得明显进展,但是由于其高度恶性和复发性,HCC患者的预后仍然很差,五年存活率仅为30%—40%。除了传统的手术治疗、放疗、化疗等方式外,生物治疗也逐渐在恶性肿瘤治疗领域中凸显其优势。生物治疗是现今一种新兴的肿瘤治疗模式,主要包括分子基因治疗、免疫治疗、细胞治疗、靶向治疗等。其中,分子靶向治疗利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性结构分子作为靶点,使用与靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法。作为分子靶向药物家族的成员之一,基于特异性抗体、偶联化疗药物（Antibody-drug conjugates,ADCs）,因其具有特异性结合肿瘤靶抗原分子,在释放小分子毒性药物的同时降低对周围正常组织的非特异性杀伤作用的优点,成为肝癌靶向治疗中研究热点。抗体药物偶联物ADCs包括特异性抗体、连接子以及小分子毒性药物,通过与肿瘤组织表面抗原特异性结合后释放小分子毒性药物来杀伤肿瘤细胞。作为ADCs技术中首要的条件,选择肿瘤组织中高表达的抗原是关键环节。c-Met由原癌基因Met编码的产物,作为生长因子受体家族成员具有酪氨酸激酶活性。c-Met在正常组织中低表达或者不表达,而在众多肿瘤组织中有明显的表达,比如肝癌、肺癌、乳腺癌等。研究已证明c-Met参与了肝细胞肝癌的发生、发展、转移和血管增生异常等多个关键性步骤,因此也成为进行抗体靶向治疗潜在的重要靶点。铂类药物从发现之初便已成为肿瘤化疗药物的重要组成成份,而作为第三代铂类药物,奥沙利铂以其表现出的广谱体外细胞毒性及体内抗肿瘤活性在多种肿瘤治疗中发挥着明显的优势,但是由于其明显的神经毒性以及胃肠道毒副反应而限制了其进一步在临床肿瘤治疗中的应用。本研究旨通过化学偶联的方式将抗c-Met抗体与奥沙利铂进行偶联,联合抗体的靶向性以及奥沙利铂的细胞毒性发挥特异性靶向杀伤肿瘤细胞的作用。在维持奥沙利铂剂量的同时以提高化疗效果,并降低奥沙利铂对正常组织的毒副反应,进一步为探索c-Met作为靶点进行肝细胞肝癌的分子靶向治疗奠定基础。研究目的:1.通过全人源免疫型Fab噬菌体抗体库构建、表达并纯化人源全分子抗c-Met抗体,分析鉴定其免疫学活性,并检测抗体亲和力;2.通过化学偶联的方式进行人源全分子抗c-Met抗体与奥沙利铂的偶联,并分析偶联物相关特性;3.在体外水平上观察和分析人源抗c-Met IgG-OXA对肝癌细胞的毒性作用;4.在体内水平观察和分析人源抗c-Met IgG-OXA在肝癌荷瘤裸鼠体内的抑瘤效果以及毒副作用情况。研究方法:1.扩增人源抗c-Met Fab抗体重轻链可变区,通过Infusion PCR构建人源全分子抗c-Met抗体真核表达载体,并使用大肠杆菌DH5α扩增后送检测序。2.将上述真核重组表达载体转染到293Freestyle（293F）细胞中,6天后收集细胞培养上清,通过Protein A亲和层析柱在AKTA蛋白纯化仪中进行纯化。3.通过免疫沉淀、质谱分析和BLItz亲和力检测的方式来验证人源全分子抗体的免疫学特性。4.构建c-Met敲除细胞株shMet-HepG2,并通过RT-PCR、qRT-PCR以及Western Blot的方式检测shMet-HepG2细胞株c-Met的表达量。5.通过氨基羧基化学偶联的合成方式,将人源全分子抗c-Met抗体和奥沙利铂进行偶联,得到偶联产物抗c-Met IgG-OXA,并用HPLC和GB/T 9723-88火焰原子吸收光谱法鉴定偶联产物的药物特性。将偶联药物置于不同pH值环境下验证其稳定性,通过ELISA、FACS分析抗c-Met IgG-OXA在蛋白和细胞水平上与c-Met的结合能力。6.通过流式细胞术以及细胞免疫荧光实验检测抗c-Met IgG-OXA在c-Met高表达HepG2以及敲减肝癌细胞shMet-HepG2中的内化能力。7.将抗c-Met IgG-OXA及游离奥沙利铂分别作用于c-Met高表达的肝癌细胞HepG2和c-Met敲除肝癌细胞shMet-HepG2,通过CCK8、细胞划痕治愈实验、Transwell侵袭实验、Annexin V/PE凋亡实验以及细胞周期实验检测抗c-Met IgG-OXA、游离奥沙利铂对细胞的毒性作用。同时比较分析,观察偶联前后奥沙利铂对不同c-Met表达水平HepG2细胞的毒性作用差异。8.使用HepG2荧光素酶细胞HepG2-luc细胞株构建HepG2-luc荷瘤裸鼠模型,使用不同浓度抗c-Met IgG-OXA和游离奥沙利铂素进行治疗,通过活体成像、瘤体体积重量监测以及肿瘤组织病理结构变化来比较不同药物的抑瘤效果。同时,比较用药后裸鼠生存情况、体重变化,腹泻程度以及心、肺、脾、肾、空肠受损情况来验证偶联药物是否降低了原先奥沙利铂的毒副作用。研究结果:1.使用全人源免疫型Fab抗体库已筛选出1株人源抗c-Met Fab抗体进行PCR扩增,其VH基因以及Vκ基因出长度分别为348bp和324bp。经Infusion PCR成功构建含人源重轻链恒定区与可变区的人源全分子抗c-Met重轻链真核重组表达载体,大肠杆菌DH5α转化大量扩增重组表达载体后测序正确。2.通过转染293 F细胞进行人源抗c-Met IgG的表达,优化后的产能约4mg/100ml,使用AKTA蛋白纯化系统进行纯化后,通过SDS-PAGE结果显示制备的抗体在55kD和25kD处条带明显,表明本次实验获取纯化后得到的抗体纯度较高。3.通过免疫沉淀实验得到抗原抗体复合物,Western blot结果显示,使用商业化抗c-Met抗体作为一抗,其抗原抗体复合物在170kD和150kD处有明显条带,说明本实验制备的抗体能够与c-Met蛋白特异性结合。使用BLltz检测抗体亲和力其KD值为5.56×10^-10,在动力学水平验证了抗c-Met IgG可以与c-Met蛋白稳定结果,具有较高的亲和力。4.采用氨基羧基化学键偶联的方式将人源抗c-Met IgG抗体分子与奥沙利铂偶联,分离纯化得到偶联物抗c-Met IgG-OXA,HPLC以及GB/T 9723-88火焰原子吸收光谱法等方法分析证实抗体以及化疗药物二者偶联成功,药物抗体比DAR为4.35:1。体外释放实验表明,在pH7.2中性条件下,抗c-Met IgG-OXA比较稳定,256 h累积释放率约为14.6%;在pH4.0酸性条件下,抗c-Met IgG-OXA能较快释放出游离的奥沙利铂,72h累积释放率为86.3%,远高于pH7.2时72 h的累积释放率8.1%。5.构建c-Met敲除肝癌细胞株shMet-HepG2,RT-PCR、qRT-PCR以及Western Blot结果表明shMet-HepG2细胞株中c-Met在核酸以及蛋白水平均有明显的下调。6.ELISA显示抗c-Met IgG-OXA与重组c-Met蛋白可特异性结合,且有明显的量效关系;FACS结果显示,抗c-Met IgG-OXA可与c-Met高表达肝癌细胞HepG2结合,而与c-Met敲除肝癌细胞shMet HepG2细胞无明显的结合能力。说明抗c-Met IgG-OXA在蛋白和细胞水平均具有较好的靶向能力。7.FACS分析表明,抗c-Met IgG-OXA能与c-Met高表达的肝癌细胞HepG2特异性结合并内化进入该细胞中,且具有明显的时间相关性,而c-Met敲除肝癌细胞shMet-HepG2细胞无明显的结合和药物内化作用。通过细胞免疫荧光实验在荧光倒置显微镜下证实,抗c-Met IgG-OXA具有上述相同的特性,能与表达c-Met的肝癌细胞特异性结合并内化入肿瘤细胞中。8.CCK-8法检测结果表明,与c-Met敲除细胞株shMet-HepG2细胞相比,抗c-Met IgG-OXA对高表达c-Met蛋白的HepG2细胞增殖的抑制率明显高于低c-Met敲除细胞株shMet-HepG2细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞划痕愈合实验结果表明:偶联药物处理后,HepG2细胞的迁移程度明显低于shMet-HepG2细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果表明:高表达c-Met蛋白的HepG2细胞对照组平均穿膜细胞数明显多于实验组,差异有统计学意义（P<0.05）,c-Met敲除细胞株shMet-HepG2细胞经偶联药物处理后其侵袭能力与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。9.Annexin V/PE凋亡实验结果表明,使用抗c-Met IgG-OXA处理高表达c-Met细胞株HepG2细胞后其凋亡率明显高于c-Met敲除细胞株shMet-HepG2细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞周期实验证实,相比shMet HepG2,抗c-Met IgG-OXA可明显促使c-Met高表达肝癌细胞HepG2出现S期的阻滞,差异具有统计学意义（P>0.05）。10.分别用不同剂量的抗c-Met IgG-OXA和游离奥沙利铂治疗HepG2-luc荷瘤裸鼠,结果观察发现抗c-Met IgG-OXA和游离奥沙利铂对肿瘤生长都有明显抑制作用,抗c-Met IgG-OXA（含奥沙利铂5mg/kg）与游离奥沙利铂（10mg/kg）具有相似的平均抑瘤率,但抑瘤效果均明显低于抗c-Met IgG-OXA（含奥沙利铂10mg/kg）治疗组。与游离奥沙利铂低剂量组（1mg/kg）相比,抗c-Met IgG-OXA低剂量组（含奥沙利铂1mg/kg）有较为明显的抑瘤效果。11.记录荷瘤裸鼠在不同剂量抗c-Met IgG-OXA和游离奥沙利铂治疗80天内的生存情况,观察发现偶联药物可以明显提高荷瘤裸鼠的生存率。裸鼠体重变化证实,抗c-Met IgG-OXA能明显减轻游离奥沙利铂单独给药所引起的体重下降。比较荷瘤裸鼠用药后腹泻情况、脾脏大小以及裸鼠空肠、心、肺、肾、脾组织H&E染色形态变化,结果显示抗c-Met IgG-OXA能明显减轻原先游离奥沙利铂对正常组织器官的损害。研究结论:本课题组成功制备全人源抗c-Met IgG,并成功通过氨基羧基化学偶联的方式将抗c-Met IgG与奥沙利铂进行偶联,制备抗c-Met IgG-OXA。抗c-Met IgG-OXA在体外水平具有明显的靶向杀伤作用,而且在体内实验中也能特异性靶向杀伤肿瘤细胞,在提高奥沙利铂抑瘤效果的同时,可以显著降低奥沙利铂对正常组织器官的毒副作用。该研究结果丰富肝细胞肝癌的治疗手段,同时为抗c-Met IgG-OXA应用于临床治疗提供研究基础。