系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematolsus, SLE)是一种弥漫性,全身性的自身免疫病,好发于青年女性,发病高峰为15-40岁,同龄男女发病比例约为1：7到1：10。SLE发病存在明显的种族地区因素差异性,世界各地报道SLE的发病率约在10-100/10万之间,我国的发病率约为70/10万。SLE患者的主要特征是血清中出现多种针对自身组织成分的自身抗体,通过免疫复合物等途径造成多种器官,多个系统的损害。其临床表现复杂多样,主要累及皮肤黏膜,骨骼肌肉,肾脏及中枢神经系统。自身免疫病的发病受遗传,环境,激素水平等因素的共同影响。既往研究发现,感染是诱发自身免疫病的最重要环境因素之一。自身免疫病的发生发展与感染有密切关系,各种病原体(细菌,病毒,寄生虫和真菌)均可使具有潜在免疫失调的人诱发自身免疫病。同一种病原体可诱导产生多种自身免疫病,但是不同的病原体也可能诱发同一种自身免疫病。而最新的研究发现,部分感染性疾病对自身免疫病还存在“保护”作用。但二者之间相互作用的具体机制尚未明确。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒科,是人类乙型肝炎的特异性病原体。据WHO估计,目前感染过HBV的人约有20亿,慢性感染的的超过3.5亿,其中75%发生在亚洲。我国是HBV感染的高发区,乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带率约占总人口的7.18%,由此推算,全国约有9300万人携带乙肝病毒,其中乙肝患者超过3000万。多项研究表明HBV感染与自身免疫病发病关系密切,其机制可能是通过分子模拟,旁观者效应,抗原表位扩增,刺激非免疫细胞表达主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, MHC)分子等刺激机体产生自身抗体和激活自身反应性T淋巴细胞,从而导致自身免疫病的发生。因此理论上HBV可能促进SLE疾病的发生与发展。但最近的临床研究发现,SLE患者HBV感染率明显低于正常人,同时,SLE患者HBeAg的阳性率明显低于对照人群,并且慢性乙肝合并SLE患者的肾脏损害程度、IFN-α、IFN-γ、抗ds-DNA抗体滴度和狼疮指数均明显低于非合并慢性乙肝SLE患者。提示HBV感染可能对SLE发生发展具有拮抗(保护)作用,但迄今缺乏HBV对SLE保护作用的实验依据,其机制尚不清楚。本文通过Pristane诱导,建立HBV转基因BALB/c小鼠和同基因型BALB/c小鼠实验性狼疮模型。通过实验性狼疮鼠自身抗体水平、肾脏损伤,探讨HBV对SLE发生的保护作用；用液相悬浮芯片技术,检测狼疮模型形成过程中相关细胞因子表达水平的变化,分析相关细胞因子水平和狼疮病理改变的相关性,探讨HBV抑制SLE病理进程的机制。通过上述研究探讨HBV对SLE的保护作用及其机制,为该疾病的临床治疗及药物靶点的选择提供理论依据及指导。第一部分HBV对实验性狼疮的保护作用目的利用BALB/c小鼠与HBV转基因鼠建立狼疮模型,并比较不同组间小鼠SLE的发病率及肾脏损伤程度。方法21只雌性BALB/c-HBV转基因小鼠及雌性同基因型BALB/c小鼠随机分为SLE造模组和对照组。造模组一次性腹腔注射降植烷0.5mL,对照组注射生理盐水0.5mL。四组小鼠分别为：一组,BALB/c-HBVTg-saline组；二组,BALB/c-HBVTg-Pristane;三组,BALB/c-saline;四组,BALB/c-Pristane组。注射前及注射后每月一次剪尾取血50μL,分离血清置于-80℃待用。腹腔注射6个月后,采用摘眼球法处死小鼠,同时收集血液至Eppendorf管(EP管)中,分离血清-80℃保存待用。间接免疫荧光法检测造模前小鼠尾静脉血清和造模后6个月血清中ANA及抗ds-DNA抗体。小鼠处死后,取肾脏组织中性甲醛固定1周后,脱水石蜡包埋后制备组织切片。应用HE染色及PAS染色后,显微镜下观察比较不同组间肾脏损伤程度差别,同时计算肾小球细胞外基质(ECM)堆积指数。各组间ANA滴度的比较采用非参数检验。各组间抗ds-DNA抗体阳性率的比较采用x2检验fisher确切概率法。肾小球ECM堆积指数比较使用采用完全随机设计的单因素方差分析方法(ANOVA),组间两两比较采用LSD检验,应用SS18.0分析软件,检验水准α=0.05。结果(1)模型小鼠存活情况：BALB/c-HBVTg-saline组,存活9只,死亡2只；BALB/c-HBVTg-Pristane组,存活8只,死亡2只；BALB/c-saline组,存活11只,死亡0只；BALB/c-Pristane组,存活10只,死亡0只。(2)HBV转基因狼疮模型鼠的ANA水平明显低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：BALB/c-Pristane组造模前后ANA阳性率的比较有显著性差异,p<0.001,说明造模成功。而BALB/c-HBVTg-Pristane组,及两组对照在造模前后阳性率变化均无统计学差异。造模后第6月时,BALB/c-HBVTg-Pristane组ANA滴度显著低于BALB/c-Pristane组,P=0.001。(3)HBV转基因狼疮模型鼠的抗ds-DNA抗体阳性率显著低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：BALB/c-Pristane组造模前后抗ds-DNA抗体阳性率的变化明显,P=0.02。BALB/c-HBVTg-Pristane组造模前后抗ds-DNA抗体阳性率的变化无统计学差异,P=0.444,两组对照组造模前后均无明显变化。造模后第6月时,HBV转基因狼疮模型鼠抗ds-DNA抗体阳性率明显低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠,P=0.025。(4)肾小球病变::肾小球HE染色显示,BALB/c及BALB/c-HBV对照组肾小球肾小球大致正常；BALB/c-Pristane组肾小球变小,系膜区增宽,系膜细胞和血管内皮细胞明显增多,炎细胞浸润,肾小球毛细血管袢开放不良,包曼囊壁有增厚；HBV转基因狼疮模型鼠仅有轻度系膜增生,肾小球病变明显较同基因型BALB/c狼疮模型鼠轻。(5)基底膜/系膜糖原沉积：用PAS染色检测基底膜/系膜糖原沉积情况。HBV转基因鼠和同基因型BALA/c鼠对照组均未见明显糖原沉积。BALB/c-pristane(模型)组糖原沉积明显增多,主要分布于肾小球基底膜及增生的系膜；BALB/c-HBVTg-pritane (HBV转基因鼠模型组)组糖原沉积轻度增多；主要分布于肾小球基底膜。(6)HBV转基因狼疮模型鼠的ECM堆积指数显著低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：狼疮模型鼠的ECM堆积指数均明显高于其对照组；而HBV转基因狼疮模型组显著低于同基因型BALB/c鼠模型组,P<0.001,即HBV转基因小鼠模型组肾脏损伤较同基因型的BALB/c小鼠模型组轻。结论1.建立了pristane诱导狼疮鼠模型。2.HBV转基因狼疮模型鼠的自身抗体(ANA和抗ds-DNA抗体)水平明显低于同基因型的BALB/c狼疮模型鼠,前者的狼疮肾炎样的病理改变也明显轻于后者。提示HBV对实验性狼疮具有保护作用。第二部分HBV对实验性狼疮保护作用的机制目的研究SLE相关细胞因子变化,探讨HBV与SLE相互作用的具体机制。方法小鼠多通道细胞因子芯片检测造模后第1个月和造模后第6个月时的小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p70、IL-17、TNF-a六种细胞因子。ELISA法检测造模后第2个月和造模后第6个月时的小鼠血清BAFF水平。各组之间细胞因子表达水平的比较使用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD检验。分析软件为SPSS18.0,双侧P<0.05认为具有统计学差异。结果(1)HBV转基因狼疮模型鼠的IL-17水平低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：BALB/c-Pristane组的IL-17水平在造模后第6个月时较造模后第1个月显著升高,P<0.001。其他各组的IL-17水平在造模后第6个月与造模后第1个月相比,差别无统计学差异。造模后第6个月,BALB/c-Pristane组与BALB/c-HBVTg-Pristane组IL-17水平均比其相应对照组显著提高,(P<0.001,P=0.014)。但HBV转基因鼠造模后IL-17水平明显低于普通BALB/c小鼠造模后水平(P=0.006)。(2)HBV转基因狼疮模型鼠的TNF-a水平显著低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：造模后第1个月,BALB/c-HBVTg-Pristane组TNF-a水平显著高于BALB/c-HBVTg-saline组(P=0.045)。BALB/c-Pristane组在造模后第6个月时血清TNF-a水平显著高于造模后第1个月,P<0.001。其他各组造模后第6个月与造模后第1个月相比,差别无统计学意义。HBV转基因鼠造模后TNF-a水平虽有显著升高,但仍明显低于普通BALB/c小鼠造模后水平(P<0.001)。(3)HBV转基因狼疮模型鼠的BAFF水平显著低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠：造模后第1个月,造模组BAFF水平均较对照组明显升高。BALB/c-Pristane组BAFF水平较BALB/c-HBV+SLE显著升高,P=0.009。造模后第6个月BALB/c-Pristane组BAFF水平较BALB/c-HBV+SLE显著升高,P=0.042,但升高程度不如造模后第2个月时显著。(4)IL-6在狼疮模型组中显著升高,但BALB/c-HBVTg-saline组升高更为显著；HBV转基因鼠的IL-2、IL-12p70水平较普通BALB/c鼠高；IL-4水平在各组中差别不明显。(5)IL-17与TNF-α(r=0.647,p<0.001)、IL-6(r=0.529,P<0.001)、IL-4(r=0.296,P=0.009)和BAFF(r=0.360,P=0.001)有明显的相关性,而与IL-2、IL-12无明显相关性。(6)IL-6与TNF-a(r=0.685,P<0.001)、IL-17(r=0.529,P<0.001)、IL-12p70(r=0.515,P<0.001)、IL-4(r=0.473,P<0.001)有明显的相关性。结论IL-17,BAFF, TNF-α三种炎性因子在狼疮模型组中均显著升高,但其在HBV转基因狼疮模型鼠中的水平显著低于同基因型BALB/c狼疮模型鼠。相关性分析显示IL-17、IL-6与其他细胞因子之间存在密切联系。提示HBV对实验性狼疮的保护作用中,细胞因子网络发挥重要作用。