禽流感病毒（AIV）属于正粘病毒科，它的致病性与毒株和宿主均有很大关系，不同毒株对同一宿主或同一毒株对不同宿主的致病性差异很大，根据毒力强弱将AIV划分为高致病性、非致病性和低致病性毒株。高致病性AIV由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率达100％，给世界养禽业造成重大损失。同时，全世界人类感染和死亡的数量也不断增加，自2003年至2007年3月1日全世界共有12个国家报告人感染禽流感，确诊病例277例，167人死亡。本研究选取肆虐全球的AIV作为研究对象，利用real-time RT-PCR中的Sybr GreenⅠ荧光染料法对不同亚型AIV在Madin-Darby canine kidney（MDCK）细胞和鸡体内的表达差异进行分析；利用Taqman探针法建立了两种快速检测AIV和H5亚型AIV的real-time RT-PCR方法，以便及时确定禽流感疫情，降低经济损失，进一步有效防控AIV在人间的广泛传播。现就主要研究内容阐述如下：靶基因的克隆及序列测定：为研究基因表达差异提供靶基因，对4株不同亚型AIV-A／Turkey／England／N28／73（H5N2）、A／Turkey／Wisconsin／1／66（H9N2）、A／AfricanStartling／England-Q／983／79（H7N1）、A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）的全基因进行克隆和序列测定。其中H5N2株的HA基因和H7N1株的6个内部基因序列已提交Genebank，登录号分别为AY500365、AY724252、AY724253、AY724254、AY724255、AY724256、AY724262。Sybr Green I real-time RT-PCR技术研究不同亚型AIV在哺乳动物体内外的表达差异：利用Sybr Green I real-time RT-PCR技术检测上述4株不同亚型AIV在体外的哺乳动物细胞（MDCK）和其中2株AIV在动物体内的表达差异，结果显示：在MDCK细胞上每株AIV的8个基因表达量基本是随着感染MDCK细胞时间的延长（6h～72h）而增加。但毒株间差异很大。H5N1除了NA基因的表达低于H7N1外，其余7个基因的表达均高于其他3株病毒；H5N1毒株感染SPF鸡后，在各组织器官中均有表达，在肺脏和脑组织中表达量最高，其次是肾脏和胰脏，这也说明了肺脏和脑是病毒入侵的主要器官。H7N1AIV接种SPF鸡后各脏器和棉拭子样品的real-time RT-PCR结果显示：该病毒感染鸡后在各组织中的分布主要集中于胰、肺和脑，肺和脑中HA、M、NS、PA基因的表达量均居前两位，NA、NP、PB1、PB2基因的表达量在胰脏中最高。快速检测AIV的Taqman real-time RT-PCR方法的建立及应用：上述4个不同亚型AIV的MDCK细胞培养物和20株不同亚型AIV的鸡胚尿囊液，提取总RNA，对AIV型特异性基因—基质蛋白基因进行检测，建立了快速检测AIV的real-time RT-PCR方法。该方法能检出10⁵稀释的鸡胚尿囊液中的AIV，比常规RT-PCR灵敏10～100倍，特异性试验未检测到鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡病毒性关节炎病毒。用该方法对临床疑似感染AIV死亡禽类的棉拭子样品、混合的脏器共350份，用real-time RT-PCR和传统的病毒滴定两种方法检测，检出率分别为41.04％，39.42％。对上述结果进行卡方检验，X²=0.19，P＞0.05，尚不能认为2种检测方法有差别。对人工感染AIV的SPF鸡采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子共264份进行real-time RT-PCR检测，并与RT-PCR方法和病毒滴定结果进行比较。结果显示：real-time RT-PCR对接种后3、5、7d的样品检出率分别为78.52％，81.30％，77.50％；RT-PCR的检出率分别为80.41％，78.60％，78.66％；病毒滴定的检出率分别为78.57％，80.00％，77.06％。对上述结果进行卡方检验X_{DPI 3}²=0.40，X_{DPI 5}²=2.62，X_{DPI 7}²=0.10 P＞0.05，尚不能认为3种检测方法有差别。快速检测H5亚型AIV的Taqman real-time RT-PCR方法的建立及应用：利用2株不同致病力的H5亚型AIV的MDCK细胞的培养物和10株H5亚型AIV的尿囊液，对H5亚型AIV的HA基因进行检测，建立了快速检测H5亚型AIV的real-time RT-PCR方法。结果表明该方法能检出10⁴稀释的鸡胚尿囊液中的AIV；特异性试验未检测到鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡病毒性关节炎病毒和H9、H7亚型AIV；重复性实验显示该方法重复性好。用建立的方法对10株H5亚型AIV感染BALB／c小鼠后的组织进行检测，与病毒滴定结果的符合率达89％；同时对来自全国各地的疑似H5亚型AIV的病料和咽喉拭子、泄殖腔拭子340份进行检测，检出率为20.31％，RT-PCR检出率为23.69％，病毒滴定的检出率为20.88％。对上述结果进行X²检验，X²=1.26，P＞0.05，尚不能认为3种检测方法有差异。