论文部分内容阅读
水稻条纹叶枯病是由纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种--水稻条纹病毒(Rice stripevirus, RSV)引起的一种严重的水稻病毒病害(Murphy F,1995)。该病自2004年从我国爆发以来,已经造成至少20个省市水稻减产,这些病害给百姓造成重大损失。对于水稻条纹叶枯病的防控,可从植物自身的抗病基因和病毒的基因两方面进行考虑。本研究采用植物自身的抗病基因WRKY蛋白来筛选抗性植株。运用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)技术检测了WRKY21和WRKY70基因mRNA分别在健康日本晴水稻和RSV侵染后表达情况。结果表明,相比健康水稻,WRKY21mRNA上调了1.5倍,WRKY70mRNA上调了3倍。为进一步研究WRKY21和WRKY70在水稻抗病中的作用,将过表达WRKY21和WRKY70转基因水稻分别接种RSV检测mRNA表达情况,WRKY21mRNA上调了2.5倍, WRKY70mRNA上调了5倍。对WRKY21和WRKY70两个基因T1代和T2代水稻植株进行潮霉素筛选阳性植株并且利用Southern杂交的方法对目的基因进行鉴定。潮霉素初步鉴定表明:WRKY21T1、T2代14株中阳性植株分别为9株和8株,WRKY70T1、T2代14株中阳性植株分别为8株和11株,通过T1代Southern杂交分别筛选出7株和4株单拷贝植株。为了保证传毒效率,对带毒灰飞虱进行带毒率检测,测得其带毒率为80%左右。利用带毒灰飞虱进行接种实验,饲毒3d后灭虫,将植株移植大田正常水肥管理。对于获得的转基因阳性植株及其后代(T1、T2代)接种RSV后20-60d后做抗病性调查。参照抗性评价标准抗病性调查表明,WRKY21转基因T1代、T2代为中感植株,WRKY70转基因T1代、T2代为中抗植株。与未转基因相比,WRKY70过表达植株发育较迟缓,发病症状较轻或者不发病。通过T1代、T2代的连续抗病性调查结果表明T1代植株RSV抗性可以遗传给T2代植株。WRKY21T1代、T2代表现为感病,并且在发病初期会出现死亡。为了进一步了解WRKY转录因子的作用,利用农杆菌介导的水稻遗传转化方法构建了WRKY21、WRKY70RNA干扰(RNA interference, RNAi)植物表达载体,通过农杆菌转化法导入日本晴水稻中,经侵染、筛选、分化、生根、炼苗等步骤获得T0代RNAi转基因植株。为下一步进行转基因后代抗病性检测奠定基础。