论文部分内容阅读
背景:miRNA是一类长度约为19~25个核苷酸的小分子单链非编码RNA,通过与靶基因mRNA 3’端非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)特定序列的碱基互补结合,导致靶基因mRNA降解或抑制蛋白质的翻译过程,从而在转录后水平调控靶基因的表达。本课题组前期研究围绕“miRNA-PXR-OATP1B1”通路开展,结果发现PXR的蛋白表达量受miR-148a转录后调控的影响,且可间接调控OATP1B1的表达。我们通过生物信息学软件Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid预测,发现miR-206/miR-613种子序列与OATP1B1 mRNA 3’-UTR互补配对,具有较高的特异性,且它们之间形成的二级结构较为稳定。那么,miR-206/miR-613能否调控OATP1B1蛋白表达,其作用机制是否与转录后调控有关,已引起了我们的高度关注。故而本研究拟借助分子生物学技术,探究miR-206/miR-613对OATP1B1基因和蛋白表达的影响,阐明其作用机制,为OATP1B1转运能力的改变而引起的药物反应个体差异研究提供新的思路。目的:研究miR-206/miR-613对Hep G2细胞中OATP1B1的mRNA及蛋白表达水平的影响;基于miRNA靶向作用OATP1B1 mRNA 3’-UTR,深入探索miR-206/613影响OATP1B1表达的机制。方法:1.采用生物信息学软件根据miRNA种子序列与OATP1B1 mRNA 3’-UTR互补结合的方式及结合位点最小自由能预测和筛选出可能靶向作用于OATP1B1mRNA 3’-UTR的miRNAs;2.分别向Hep G2细胞中转染miR-206/miR-613拟似物(mimic)或抑制物(inhibitor),运用RT-qPCR方法检测Hep G2细胞中miR-206/miR-613表达水平,验证过表达或抑制表达miR-206/miR-613的Hep G2细胞细胞模型是否构建成功;3.分别向Hep G2细胞中转染miR-206/miR-613 mimic或inhibitor,运用RT-qPCR和Western blot等分子生物学方法检测OATP1B1 mRNA及蛋白表达水平,探究过表达或抑制表达miR-206/miR-613对Hep G2细胞OATP1B1 mRNA和蛋白表达的影响;4.采用双荧光报告基因法,研究miR-206/miR-613作用于OATP1B1表达的确切机制:首先,将OATP1B1 mRNA的3’-UTR序列克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体中,得到pMIR/OATP1B1-WT报告质粒,与miR-206/miR-613 mimic或inhibitor转染至HEK293T或Hep G2细胞中,检测miR-206/miR-613对报告基因荧光素酶活性的影响;其次,以定点突变方式突变OATP1B1 mRNA 3’-UTR上miR-206/miR-613的结合位点,继而克隆、质粒转染和检测荧光素酶活性;再次,比较突变前后荧光素酶活性的差异,从而分析miR-206/miR-613对OATP1B1影响的作用位点;5.数据处理与统计分析:各实验组的数据均以均数±标准差(mean±SD)表示,用Graphpad Prisms v5.0软件作图,并用SPSS软件进行单因素方差分析比较实验组与对照组之间的差异性;统计结果以P<0.05表示差异具有统计学意义,P>0.05表示差异无统计学意义。结果:1.通过Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid等生物信息学软件分析,发现miR-206/miR-613种子序列与OATP1B1 mRNA 3’-UTR互补配对,具有较高的特异性,且它们之间形成的二级结构较为稳定。2.Hep G2细胞中转染miR-206 mimic作用48 h后,对照组与miR-206 mimic组miR-206相对表达水平分别为1.00±0.00、1227.85±142.42,与对照组相比,miR-206表达水平上调了1227.85倍;而以miR-206 inhibitor作用Hep G2细胞48 h后,对照组与miR-206 inhibitor组miR-206相对表达水平分别为1.00±0.00、0.48±0.13,即miR-206表达水平仅为对照组的0.48倍;与此相同,Hep G2细胞中转染miR-613mimic作用48 h后,与对照组相比,miR-613表达水平上调了935.38倍;而以miR-613inhibitor作用Hep G2细胞48 h后,miR-613表达水平却仅为对照组的0.67倍;由此可见,我们已成功建立了过表达或抑制表达miR-206/miR-613的Hep G2细胞模型。3.miR-206/miR-613 mimic转染后的Hep G2细胞中OATP1B1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、1.29±0.41、1.05±0.32,各组差异无统计学意义(P>0.05),而OATP1B1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.02、0.75±0.02、0.61±0.01,与对照组相比下调24.7%、38.8%,差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-206/miR-613inhibitor转染后的Hep G2细胞中OATP1B1 mRNA相对表达表达水平分别为1.0±0.00、1.16±0.16、1.17±0.21,各组差异无统计学意义(P>0.05),而OATP1B1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.06、1.25±0.07、1.38±0.08,与对照组相比上调25%、38.2%,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.通过双荧光报告基因实验,我们发现miR-206/miR-613 mimic可显著抑制pMIR/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性,各组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.03、0.65±0.05、0.70±0.03,与对照组相比荧光素酶活性分别下降35%和30%,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-206/miR-613 inhibitor可诱导荧光素酶活性,各组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.04、1.33±0.12、1.33±0.12,与对照组相比荧光素酶活性分别增加33.1%和32.5%,差异具有统计学意义(P<0.05);而在OATP1B1 mRNA 3’-UTR miR-206/miR-613结合位点突变的报告基因系统中,miR-206/miR-613 mimic和inhibitor对荧光素酶活性均无影响,各组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.05、1.15±0.14、1.03±0.175和1.00±0.01、0.96±0.04、1.00±0.09,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本研究建立的过表达或抑制表达miR-206/miR-613的Hep G2细胞模型,该模型用于基因和蛋白水平上的实验研究具有良好的可重复性。2.miR-206和miR-613对OATP1B1的蛋白表达具有确切的调控作用,但对OATP1B1 mRNA的表达差异无统计学意义;提示miR-206和miR-613可能是在转录后水平上调控OATP1B1的蛋白表达。3.miR-206/miR-613 mimic或inhibitor与OATP1B1 mRNA 3’-UTR结合从而抑制或诱导pMIR/OATP1B1-WT报告基因的活性,当结合位点突变后,miR-206/miR-613 mimic和inhibitor对报告基因的活性则无影响;这就确证了miR-206和miR-613是与OATP1B1 mRNA 3’-UTR结合从而转录后调控OATP1B1表达。