猪卵母细胞双向电泳分析方法的建立

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本论文的研究内容是猪卵母细胞蛋白质组中双向电泳平台的建立和优化以及卵母细胞成熟过程中蛋白质表达的差异性。论文共分三章,第一章为文献综述,第二章和第三章为实验研究部分。第二章研究目的是卵母细胞双向电泳平台的建立,并对裂解液的组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺电泳染色方法等相关技术进行比较和优化,能够得到清晰的电泳图谱,为卵母细胞成熟过程中蛋白表达差异性研究打下基础。先利用十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术对未成熟和成熟猪卯母细胞进行蛋白质表达差异性研究,发现成熟前后卵母细胞的电泳图谱基本相同。在熟练操作第二向的基础上进行建立和优化猪卯母细胞蛋白质组分析所需的双向电泳及相关技术。以一步裂解法(8M尿素,4%(w/v)CHAPS,2%(v/v)IPG缓冲液(pH3-10),40mM Tris,70mM DTT)裂解超声后超速离心来提取总蛋白,商品化13cm固相pH胶条(pH 3-10)等电聚焦为第一向,采用主动水化上样,上样量为100μg,银染聚焦程序为30V,6h、60V,6h、500V,4h、1000V,1h,8000V、7h。以SDS均一胶(T=12.5%)的垂直电泳为第二向,采用通用的硝酸银染色程序,成功地得到了清晰的猪卵母细胞双向电泳图谱。第三章的研究目的分别对未成熟和成熟猪卵母细胞进行双向电泳,用ImageMaster软件进行分析比对,找出蛋白表达差异点,为下一步研究打下基础。采用第二章建立的双向电泳平台对成熟前后的去除卯丘细胞的卯母细胞进行电泳,得到了清晰的重复率高的电泳图谱后,用ImageMaster对图谱进行比对分析,发现一张图谱上大约有800左右的蛋白点,其中差异蛋白点35个,其中上调蛋白22个,下调蛋白13个。说明基于双向电泳的蛋白质组学可以用于卵母细胞的成熟的分子机制的研究,发生改变的这些差异蛋白可能在卵母细胞发育过程中发挥作用,或是卵母细胞发育成熟的标志物。有助于揭开“生命启动”之迷,更深一步的理解繁殖与发育的机理。
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