目的:铁调素(Hepcidin)是一种主要由肝脏合成并分泌的肽类激素,是机体内铁的主要调节者[1]。Hepcidin启动子的-64/-72位置是信号转导和转录激活3(STAT3)绑定基序,炎症条件下尤其是白细胞介素6(IL-6)升高时,可通过Janus激酶(JAK)-STAT3信号通路调节Hepcidin的合成。增多的Hepcidin可通过减少铁的吸收,增强细胞内铁储存、促进细胞生存等途径导致慢性炎症、感染和癌症等慢性病[2]。肿瘤患者血清和组织中Hepcidin升高通常被认为是细胞因子的水平增加的间接后果和细胞因子对Hepcidin合成的刺激作用[3]。Hepcidin的合成部位并不仅限于肝脏,肿瘤组织本身在癌症中观察到增高的Hepcidin上也起到重要的作用。Hepcidin表达失调不仅改变了全身的铁的调节,还对肿瘤的生长和恶性转化发挥局部作用,因此Hepcidin在铁稳态和参与肿瘤发生发展的过程中扮演着重要的角色[4]。Hepcidin通过结合在肠上皮细胞和网状内皮系统的巨噬细胞表达的铁外排泵膜铁转运蛋白1(FPN1)并触发FPN1降解,从而阻断铁从肠上皮细胞输送到全身血液循环以及阻止被巨噬细胞分解代谢的铁输送到血液循环[5],因此,铁通过Hepcidin或调控Hepcidin表达的蛋白质包括炎症介质或FPN在肿瘤发生发展中发挥作用,为铁及Hepcidin的靶向抗肿瘤治疗奠定基础[6]。因此,本研究主要探讨胃癌血清和组织中Hepcidin水平是否增高、IL-6-STAT3信号通路是否参与调控Hepcidin水平,探讨Hepcidin水平变化对胃癌增殖及转移的影响及其具体机制。通过上述研究目的是确定Hepcidin在胃癌中的表达水平及其调控通路、Hepcidin对胃癌细胞增殖及转移的影响及其具体机制,为Hepcidin能够成为肿瘤诊断及转移的标志物并转化应用于临床实验室奠定基础。第一部分:IL-6-STAT3信号通路调控胃癌铁调素水平方法:1.应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测血清中Hepcidin和IL-6水平,并统计分析Hepcidin与IL-6水平的相关性。2.应用实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescent Quantitative PCR,RTFQ-PCR)法检测组织中Hepcidin m RNA和肿瘤转移基因Tiam1 m RNA的量值水平,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测组织中Hepcidin蛋白和IL-6下游信号分子磷酸化STAT3(p STAT3)蛋白的表达,并统计分析胃癌组织中Hepcidin m RNA与临床病理学特征及Tiam1m RNA的关系、Hepcidin蛋白与p STAT3蛋白表达的关系。3.应用实时荧光定量PCR法和Western Blot法检测外源性IL-6处理的胃癌细胞株中Hepcidn m RNA、Hepcidin蛋白和p STAT3蛋白水平的变化,应用细胞免疫荧光实验检测Hepcidin的表达定位,证实IL-6-STAT3信号通路参与调控胃癌中Hepcidin水平。结果:1.胃癌组血清中Hepcidin水平为10.38(7.10,19.35)ng/ml,高于胃良性病变组7.43(1.88,12.05)ng/ml和胃正常对照组7.40(4.08,12.05)ng/ml、差异具有统计学意义(P<0.05),而胃良性病变组与胃正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌组血清中IL-6水平为3.16(1.69,4.87)pg/m L,高于胃正常对照组0.87(0.56,0.99)pg/m L、差异具有统计学意义(P<0.05),低于胃良性病变组4.17(2.36,5.27)、差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌组血清中Hepcidin和IL-6水平呈正相关(r=0.459,P=0.000)。2.胃癌组和胃良性病变组组织中Hepcidin m RNA表达阳性率分别为61.54%(40/65)和58.82%(10/17),高于胃正常对照组25%(5/20),差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平为-0.38±1.05,高于胃良性病变组-0.51±0.65和胃正常对照组-1.65±0.89,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组和胃良性病变组组织中Hepcidin蛋白表达阳性率分别为60.00%(39/65)和58.82%(10/17),高于胃正常对照组20.00%(4/20),差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组和胃良性病变组组织中p STAT3蛋白表达阳性率分别为46.15%(30/65)和47.06%(8/17),高于胃正常对照组0(0/20),差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组组织中Hepcidin蛋白和p STAT3蛋白表达呈正相关。3.随着外源性IL-6浓度的增加,Hepcidin m RNA和蛋白、p-STAT3蛋白表达升高,当IL-6浓度为20ng/ml时,Hepcidin m RNA量值水平最高、Hepcidin蛋白和p STAT3蛋白表达最高。细胞免疫荧光实验显示Hepcidin蛋白在胃癌细胞中表达,且主要集中于细胞浆及近细胞膜部分。IL-6-STAT3信号通路参与调控胃癌细胞中Hepcidin的水平。第二部分:Hepcidin水平影响胃癌细胞的增殖及转移方法:1.统计分析胃癌血清和组织中Hepcidin与临床病理学特征和肿瘤转移基因Tiam1的关系2.使用外源性Hepcidin处理胃癌细胞,使其处于高Hepcidin微环境中,应用MTT法和细胞划痕愈合实验检测外源性Hepcidn对胃癌细胞增殖及转移的影响。3.构建并转染Hepcidin真核表达载体提高细胞内Hepcidin水平、RNA干扰技术降低细胞内Hepcidin水平,通过流式细胞实验和细胞划痕愈合实验检测增高和降低细胞内Hepcidin对胃癌细胞增殖及转移的影响。结果:1.按肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床TNM分期分组统计,T3+T4期胃癌组血清中Hepcidin的水平为11.26(8.64,23.77)ng/m L,高于T1+T2期8.78(3.66,11.25)ng/m L,差异具有统计学意义(P=0.017);N1-3期胃癌组血清中Hepcidin的水平为10.73(7.90,22.35)ng/m L,高于N0期10.18(5.31,12.78)ng/m L、但差异无统计学意义(P=0.280);M1期胃癌组血清中Hepcidin的水平为10.72(8.60,30.85)ng/m L,高于M0期10.36(4.31,18.48)ng/m L,但差异无统计学意义(P=0.215);Ⅲ+Ⅳ期胃癌组血清中Hepcidin的水平为11.21(8.56,20.60)ng/m L,高于Ⅰ+Ⅱ期9.31(3.83,17.01)ng/m L,但差异无统计学意义(P=0.240);胃癌组血清Hepcidin的水平与浸润深度有关,但与淋巴结转移、远处转移及临床TNM分期无关。T3+T4期胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平为-0.23±0.84,高于T1+T2期-0.74±0.50,差异具有统计学意义(P=0.038);N1-3期胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平为-0.39±0.81,高于N0期-0.66±0.55,差异具有统计学意义(P=0.046);M1期胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平为-0.25±0.70,高于M0期-0.65±0.50,差异具有统计学意义(P=0.043);Ⅲ+Ⅳ期胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平为-0.23±0.75,高于Ⅰ+Ⅱ期-0.63±0.47,差异具有统计学意义(P=0.030);胃癌组组织中Hepcidin m RNA量值水平与浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床TNM分期呈正相关。胃癌组组织中Hepcidin m RNA和Tiam1 m RNA量值水平呈正相关(r=0.908,P<0.05)。T3+T4期胃癌组血清中IL-6的水平为2.51(1.74,4.72)ng/m L,低于T1+T2期3.25(1.60,5.25)ng/m L,但差异无统计学意义(P=0.561);N1-3期胃癌组血清中IL-6的水平为2.75(1.73,4.57)ng/m L,低于N0期3.27(1.50,5.69)ng/m L、但差异无统计学意义(P=0.674);M1期胃癌组血清中IL-6的水平为3.46(2.05,4.91)ng/m L,高于M0期2.80(1.55,4.87)ng/m L,第二部分:Hepcidin水平影响胃癌细胞的增殖及转移方法:但差异无统计学意义(P=0.597);Ⅲ+Ⅳ期胃癌组血清中IL-6的水平为3.38(1.86,4.98)ng/m L,高于Ⅰ+Ⅱ期2.75(1.59,4.37)ng/m L,但差异无统计学意义(P=0.575)。2.外源性Hepcidin处理胃粘膜上皮细胞GES1和胃癌细胞株SGC7901后,MTT实验结果显示随着Hepcidin浓度的增加,吸光度(OD值)增高,提示胃粘膜上皮细胞GES1增殖能力增强;细胞划痕愈合实验结果显示随着Hepcidin浓度的增加,划痕两边细胞向中央生长、划痕距离缩小,提示胃癌细胞SGC7901迁移能力增强。3.转入Hepcidin真核表达载体的胃癌细胞SGC7901中Hepcidin m RNA量值水平高于转入空载体的胃癌细胞SGC7901,差异有统计学意义(P<0.05),Hepcidin蛋白表达升高,提示Hepcidin真核表达载体转进胃癌细胞SGC7901并稳定表达Hepcidin;流式细胞实验结果显示实验组胃癌细胞SGC7901的G0/G1期为47.06%低于对照组57.32%,S2期和G2期为52.94%高于对照组42.68%,提示升高Hepcidin对胃癌细胞SGC7901的增殖生长有促进作用;细胞划痕愈合实验显示实验组划痕两边细胞向中央生长、划痕距离缩小,提示升高Hepcidin对胃癌细胞SGC7901迁移有促进作用。4.si RNA沉默Hepcidin基因的胃癌细胞MGC803中Hepcidin m RNA量值水平低于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05),Hepcidin蛋白表达降低,提示MGC803胃癌细胞中Hepcidin被沉默并表达降低;流式细胞实验结果显示实验组MGC803胃癌细胞G0/G1期为46.12%高于对照组38.10%,S2期和G2期为53.88%低于对照组62.90%,提示降低Hepcidin对MGC803胃癌细胞的增殖生长有抑制作用,细胞划痕实验研究实验组划痕两边细胞向中央生长少、划痕距离未缩小,提示降低Hepcidin对MGC803细胞的迁移有抑制作用。第三部分:Hepcidin-Ferroportin信号通路促进胃癌细胞增殖及转移方法:1.应用实时荧光定量PCR法检测胃癌组织和胃癌细胞中FPN m RNA水平,统计分析胃癌组织中FPN与临床病理学特征的关系、胃癌组织和细胞中Hepcidin和FPN水平的关系。2.应用实时荧光定量PCR法和红菲绕啉法检测外源性Hepcidin处理后胃癌细胞株中FPN和可利用铁池的水平变化,研究Hepcidin-FPN-Iron信号通路参与胃癌细胞的增殖及转移。结果:1.胃癌组和胃良性病变组组织中FPN m RNA表达阳性率分别为30.77%(25/65)和29.41%(5/17),低于胃正常对照组75%(15/20),差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组组织中FPN m RNA量值水平为-0.54±0.51,低于胃良性病变组-0.31±0.58和胃正常对照组-0.15±0.60,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组组织中FPN与Hepcidin m RNA的量值水平呈负相关(r=-0.747,P=0.000)。T3+T4期胃癌组组织中FPN m RNA量值水平为-0.54±0.36,低于T1+T2期-0.21±0.66,差异具有统计学意义(P=0.035);N1-3期胃癌组组织中FPN m RNA量值水平为-0.56±0.66,低于N0期-0.26±0.56,差异具有统计学意义(P=0.034);M1期胃癌组组织中FPN m RNA量值水平为-0.55±0.42,低于M0期-0.27±0.48,差异具有统计学意义(P=0.043);Ⅲ+Ⅳ期胃癌组组织中FPN m RNA量值水平为-0.56±0.32,低于Ⅰ+Ⅱ期-0.29±0.41,差异具有统计学意义(P=0.045);胃癌组组织中FPN m RNA量值水平与浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床TNM分期呈负相关。高表达Hepcidin的胃癌细胞,FPN表达降低,相反低表达Hepcidin的胃癌细胞,FPN表达升高,胃癌细胞中FPN与Hepcidin表达呈负相关。2.外源性Hepcidin处理胃癌细胞后,随着Hepcidin浓度的增加,FPN m RNA和蛋白水平降低,可利用铁池水平升高,Hepcidin通过调控FPN和可利用铁池即Hepcidin-FPN-Iron信号通路参与胃癌细胞增殖及转移。结论:1.通过血清中Hepcidin和IL-6、组织中Hepcidin和p STAT3的检测、得出胃癌中Hepcidn、IL-6、Hepcidn m RNA、Hepcidin蛋白和p STAT3蛋白是升高的,并且Hepcidin与IL-6水平、Hepcidin蛋白与p STAT3蛋白表达呈正相关;通过IL-6处理胃癌细胞中p STAT3蛋白、Hepcidin m RNA和Hepcidin蛋白的变化的检测,得出IL-6水平升高,可导致p STAT3蛋白形成,进而增加Hepcidin的水平,证实了IL-6-STAT3信号通路能够正向调控胃癌中Hepcidin水平。2.通过胃癌组血清和组织中Hepcidin与临床病理学特征的关系,得出Hepcidn与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关。进一步通过加入外源性Hepcidin、转染表达质粒提高细胞内Hepcidin表达、转染si RNA降低细胞内Hepcidin表达,使用MTT法、流式细胞实验和细胞划痕实验检测细胞增殖、细胞周期和细胞迁移能力的变化,证实升高Hepcidin水平能够促进胃癌细胞增殖及转移,降低Hepcidin水平能够抑制胃癌细胞增殖及转移。3.通过组织和细胞中FPN和Hepcidin水平、血清铁、外源性Hepcidin处理胃癌细胞株中FPN和可利用铁池水平变化的检测,得出Hepcidin是通过绑定到膜铁转运蛋白FPN并触发其内化进而增加细胞内铁来促进胃癌细胞增殖及转移的,证实Hepcidin-FPN-Iron在肿瘤恶性转化中发挥重要作用。