骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种严重危害中老年人健康的慢性退行性骨关节病,临床上以膝关节发病最常见。随着社会人口的老龄化,该病的发病率日益上升,我国约有6000万～7000万人患不同程度的OA。按美国风湿病协会分类,OA分为原发性和继发性两种,原发性OA是目前研究的重点。透明质酸(hyaluronacid, HA)是一种大分子分散性线形糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG),由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的重复双糖所组成,是关节滑液以及软骨基质的重要成分。20世纪70年代,Peyron等首先应用关节腔注射HA治疗OA患者,并形成了OA的黏弹性补充疗法。但天然HA具有易溶于水、在体内易降解、存留时间短等缺点,需要重复注射给药。利用HA长链中的羧基、羟基和N-乙酰氨基三种官能团,使其与不同的交联剂反应可得到不同类型的交联透明质酸(cross-linked hyaluronacid,CHA)。CHA相对分子质量Mr和分子体积显著增大,形成了连续的大分子网状结构,在水中可溶胀但不再溶解,不仅保持了天然HA良好的生物相容性和体内可降解性,而且具有更好的流变性能,机械强度和较高的稳定性,延长其在体内的存留时间。本课题研究了1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-Butanediol diglycidyl ether,BDDE)与HA交联制得不同交联度的CHA凝胶,比较了三种CHA凝胶的流变学、抗自由基、抗酶降解等特性,并将CHA凝胶用于OA动物模型,探讨其对OA的治疗作用及机制。研究中取得了以下几个方面的成果。1制备了BDDE交联的CHA凝胶研究制备了BDDE交联的CHA凝胶,所建立的工艺与其他文献以及专利相比简单易行,且产品的纯度高。2考察了CHA凝胶的性质对CHA凝胶进行了流变学性质的研究。CHA凝胶与天然HA凝胶的黏度随剪切频率的增加而减少,其黏度表现出一种假塑性现象,CHA凝胶与天然HA凝胶这两种高分子多聚物,均属于非牛顿流体。CHA凝胶较天然HA凝胶相比弹性模量G’和黏性模量G”都显著升高,且G’远远大于G”, G’、G”对频率的依赖性不明显,且其δ角较小,CHA凝胶具有高弹性、强凝胶的特性。另外分别对CHA凝胶进行抗自由基以及抗酶降解能力实验。随着交联度的增加,CHA抵抗自由基以及透明质酸酶的降解能力逐渐增强。3研究了CHA凝胶对OA动物模型的治疗作用建立了木瓜蛋白酶诱导的兔膝OA模型,用CHA凝胶兔膝关节腔内单次注射,与生理盐水和HA 5次注射每周一次为对照。给药5周,取关节软骨和滑膜进行光镜观察,观察关节软骨和滑膜变化情况。结果发现,CHA凝胶均可显著减轻兔膝OA,症状,疗效与生理盐水组相比有显著性差异。4研究了CHA凝胶对兔膝OA的部分作用机制研究检测了治疗后兔膝OA模型关节滑液中的IL-1β、TNF-α水平,发现CHA可显著降低IL-1β和TNF-α的表达水平,与生理盐水组相比,有显著性差异。实验还用高效液相色谱法检测了HA及CHA对软骨蛋白聚糖aggrecan的影响,CHA及HA凝胶可显著降低滑液中硫酸软骨素的含量,可能是通过抑制软骨蛋白聚糖aggrecan的降解或上调蛋白聚糖的合成,对维持关节软骨正常的新陈代谢发挥了作用。本研究取得的主要研究成果和结论如下：(1)研究了以BDDE为交联剂制备不同交联度CHA凝胶的工艺,该工艺简单易行,并且具有产品纯度高凝胶颗粒均匀等特点,适合工业化生产。(2)流变学测定CHA黏性模量和弹性模量较天然HA高,CHA凝胶具有高弹性、强凝胶的特性。(3)抗酶和抗自由基实验证明了CHA凝胶具有较强的稳定性,能较强地抵抗透明质酸酶和羟自由基的降解,延长其在体内存留时间。(4)考察pH值及不同的缓冲体系对CHA稳定性的影响,CHAⅠ、CHAⅡ、CHAⅢ在pH为5.0～9.0的条件下性质都比较稳定。CHAⅡ在pH8.0的硼酸盐缓冲体系,以及pH 6.0、pH7.0、pH8.0的磷酸盐缓冲体系,pH7.0、pH8.0的枸橼酸盐缓冲体系都可稳定存在。(5)用木瓜蛋白酶诱导的兔膝OA模型考察CHA凝胶对OA的疗效,研究证实CHA可减少给药次数,保护关节软骨,减轻炎症,显著改善兔膝OA症状。(6)从免疫分子水平探讨了CHA凝胶对OA的部分作用机制,发现CHA可显著降低兔膝OA模型关节滑液中IL-1β和TNF-α的表达水平。高效液相色谱测定关节滑液中硫酸软骨素的含量,发现CHA及HA可显著降低滑液中硫酸软骨素的含量,可能由此对软骨蛋白聚糖aggrecan的降解起延缓作用,对维持关节软骨正常的新陈代谢发挥了作用。