研究背景：脓毒症是目前世界范围内感染致死的主要原因;是全球十大死亡原因之一。全球每天约有一万多人死于不同部位不同病原体感染引起的脓毒症;其导致的死亡人数超过了艾滋病、乳腺癌和前列腺癌致死人数的总和。但尽管经历了 100 多年的临床研究;开发的潜在抗脓毒症药物仍然令人特别失望。随着抗脓毒症药物 Xigris 从市场全面撤回;目前缺乏有效的治疗来提高患者的生存率。因此;探索脓毒症的发病机制;探寻新的脓毒症治疗方法至关重要。　　PGRN 是一种多效能的生长因子;多项研究表明它在炎症反应、免疫调节、宿主防御以及损伤修复等多种生理病理过程中发挥重要作用;特别是近年来发现其在天然免疫应答的调控中发挥的作用至关重要。我们近期实验也发现 PGRN 在脓毒症时表达显著升高。在动物实验中;PGRN-/-小鼠与WT小鼠相比;其对脓毒症具有更高的易感性;死亡率显著增高;同时清除细菌的能力降低;多器官损伤加重;提示PGRN 在脓毒症期间可能发挥了重要的保护性作用;但机制尚不清楚。　　目的：本研究将在明确 PGRN 在脓毒症中发挥保护作用的基础上;进一步通过一系列分子生物学和免疫学方法阐明 PGRN 在脓毒症中所发挥的免疫保护作用机制;并通过给予rPGRN蛋白以明确PGRN在脓毒症中的治疗作用。为脓毒症的机制研究提供新的实验证据;同时为脓毒症的免疫新疗法开辟新的思路。　　方法：从重庆医科大学附属第一医院和重庆医科大学附属儿童医院收集成年脓毒症患者和儿童脓毒症患者的临床血标本;经ELISA法检测 PGRN 的表达水平;然后经 CLP 术建立小鼠脓毒症模型;经ELISA法验证PGRN在脓毒症中的表达;利用生存率实验、细菌载量测定、组织病理切片HE染色、TUNEL法检测细胞凋亡以及常见生化指标的检测等方法明确 PGRN 在脓毒症中发挥的保护作用。通过宏基因组学分析WT小鼠与PGRN-/-小鼠的肠道菌群差异。利用过继转移试验明确发挥保护作用的 PGRN 在体内是否来源于骨髓源性细胞。为阐明PGRN影响细菌清除的机制;通过采用FCM分析PLF中的WBC募集情况以及ELISA法检测炎症细胞因子的水平;以明确PGRN在脓毒症炎症应答中的调控作用。经免疫磁珠分选法分离培养天然免疫中发挥抗菌防御作用的巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞;通过体外实验探索 PGRN 对该天然免疫细胞的吞噬杀菌功能的影响;对募集增加的免疫细胞相关的趋化因子经ELISA法进行检测;进一步明确PGRN对免疫细胞趋化作用的间接调控;最后经腹腔注射rPGRN对脓毒症小鼠进行治疗以探索PGRN对脓毒症的治疗作用;明确PGRN在脓毒症中的潜在药用价值。　　结果：　　1. PGRN在脓毒症时表达增高;且发挥重要的保护作用6　　1）经ELISA法检测临床脓毒症患者血中的PGRN 水平;结果显示 PGRN 在脓毒症患者（成人和儿童）外周血中表达显著升高。然后建立脓毒症动物模型;经ELISA法检测PGRN水平;显示PGRN在脓毒症小鼠外周血、PLF和脾脏中也均表达升高;但脓毒症TLR2-/-小鼠和脓毒症TLR4-/-小鼠较脓毒症WT小鼠PGRN表达水平降低;说明脓毒症期间PGRN的产生部分依赖上游的TLR2和TLR4通路。　　2）生存率试验显示;在CLP诱导的脓毒症中;与WT小鼠相比; PGRN-/-小鼠生存率显著降低（全部死亡）;WT 小鼠仍有 100%生存率;而且在腹腔注射 S.aureus 诱导的脓毒症模型中得到一致的结果; PGRN-/-小鼠生存率显著降低（20%生存率）;WT小鼠有80%生存率;然后用PGRN中和抗体将WT小鼠体内的PGRN中和之后建模;小鼠生存率也显著降低（降低约 40%）;与前述结果吻合。同时;在脓毒症动物模型中;与WT相比;PGRN-/-小鼠在PLF、外周血和脾脏中的菌载量显著升高;细菌清除能力减弱。　　3）通过宏基因组学分析小鼠肠道微生物;结果显示 PGRN-/-小鼠与WT相比;其肠道菌群种类没有显著差异;说明PGRN-/-小鼠对脓毒症易感性增加并非受肠道菌群差异的干扰。　　4）进一步组织病理学 HE染色结果显示 PGRN-/-小鼠与WT小鼠相比;其在脓毒症6h和24h时;其肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等多器官炎症损伤加重;脓毒症24h时;PGRN-/-小鼠血清中反映肝细胞损伤的转氨酶ALT和AST显著升高（ALT;P<0.001;AST;P<0.01）;与组织细胞广泛损伤有关的 LDH 也显著升高(P<0.01);但反映肾脏损伤的Cr水平无显著差异。　　5）此外;经TUNEL法检测多器官细胞凋亡后发现;PGRN-/-小鼠较 WT 小鼠在脓毒症 6h 和 24h 时;脾细胞和肝细胞凋亡显著增加（P<0.001）;且脾细胞凋亡最显著;视野中多见凋亡强阳性细胞;脓毒症6h时肾脏细胞凋亡略有增加（P<0.05）。　　2. 造血细胞来源的PGRN在脓毒症中发挥了重要保护作用　　过继转移试验结果显示;WT(BM) to WT(host)组有 100%的生存率;PGRN-/-(BM) to WT(host)组的小鼠死亡率为100%;而具有正常造血系统的PGRN-/-小鼠（WT (BM) to PGRN-/-(host)）仍有60%的生存率。表明在脓毒症中发挥保护作用的PGRN主要来源于造血系统。　　3. PGRN缺陷导致脓毒症小鼠PLF中的巨噬细胞显著减少　　1）在脓毒症模型中;通过牛鲍计数板计数PLF中的WBC数目;结果显示脓毒症PGRN-/-小鼠PLF中WBC数目减少。进一步流式结果显示 CD11b+Ly6G+中性粒细胞、CD45+CD3+ T 淋巴细胞以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例均没有显著差异;但脓毒症6h和24h时CD11b+F4/80+的巨噬细胞在脓毒症PGRN-/-小鼠的PLF中显著减少（6h时P<0.05;24h时P<0.01）。　　2）体外分离培养小鼠巨噬细胞和中性粒细胞做吞噬杀菌试验;结果显示来自PGRN-/-小鼠的原代中性粒细胞和巨噬细胞与来自WT小鼠的原代中性粒细胞和巨噬细胞相比;吞噬功能均没有显著差异;给予rPGRN蛋白处理也没有增加WT小鼠来源的巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬功能;rPGRN 处理也没有改变巨噬细胞和中性粒细胞中的 Akt;JNK;p38MAPK;Erk1/2及NF-κB等信号分子的磷酸化。PGRN缺陷减少了巨噬细胞的募集;并没有影响巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀菌功能。　　4. PGRN缺陷导致中性粒细胞和淋巴细胞分泌的CCL2显著降低　　通过ELISA法进一步检测炎症细胞因子和趋化因子后发现;在脓毒症 6h 和 24h 时;PGRN-/-小鼠较 WT 小鼠产生更高水平的 IL-6; TNF-α以及HMGB1等炎症细胞因子;但在脓毒症早期（6h时）PGRN-/-小鼠 PLF 中的巨噬细胞趋化因子 CCL2 （ MCP-1 ）水平显著降低（P<0.001）。而其他细胞因子（IFN-γ、IL-1β、CXCL1以及CXCL10）没有显著差异。分离WT小鼠和PGRN-/-小鼠BM中的WBC;经体外培养和细菌刺激后检测 CCL2 的表达;发现 PGRN-/-小鼠 BM 来源的WBC分泌CCL2的水平显著降低;与体内实验结果一致;进一步经免疫磁珠分选中性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞等不同 WBC 经体外培养并检测上清中的CCL2水平;发现PGRN-/-小鼠来源的中性粒细胞分泌的CCL2水平显著降低（P<0.001）;淋巴细胞分泌CCL2也有部分降低;而巨噬细胞本身分泌CCL2并未降低。提示PGRN主要通过调控中性粒细胞分泌CCL2而增强巨噬细胞趋化。　　5. rPGRN对脓毒症的保护作用依赖于CCL2对巨噬细胞的趋化　　经CLP术建立脓毒症模型后腹腔注射rPGRN蛋白;结果rPGRN显著提高了脓毒症小鼠的生存率（生存率提高 40%-50%）。然后将PGRN-/-小鼠建模后经腹腔注射给予rCCL2蛋白;结果rCCL2蛋白处理组小鼠生存率显著提高（生存率提高约 30%）;腹腔巨噬细胞募集增加（P<0.05）;PLF和外周血中菌载量降低（P<0.05）。当我们进一步将巨噬细胞敲除之后建模;再给予rPGRN蛋白治疗时;敲除巨噬细胞的脓毒症小鼠在rPGNR治疗后生存率没有得到恢复;PGRN的保护作用消失。说明PGRN在脓毒症中的保护作用是CCL2和巨噬细胞依赖性的。　　结论：PGRN 在脓毒症患者及脓毒症动物模型中均表达显著增高;并发挥了重要的保护作用。初步阐明了其保护作用机制;脓毒症激活机体全身免疫应答;造血细胞来源的 PGRN 通过调控中性粒细胞和淋巴细胞分泌 CCL2 而招募巨噬细胞至感染部位;从而增强细菌清除;控制炎症;减轻器官损伤;减少淋巴细胞凋亡;最终降低死亡率。给予外源性的rPGRN蛋白对脓毒症具有显著的治疗效果;能够显著提高脓毒症小鼠的生存率;具有良好的潜在药用价值和巨大的临床应用前景。　　第二部分　　目的：脓毒症诱导的多器官功能障碍导致患者死亡主要分两个时相;一是脓毒症早期;部分患者死于急性感染所致的炎症失控;以及复苏不充分导致的急性心肺衰竭;而另一部分患者则在脓毒症数周之后死于持续性的器官损伤及衰竭;而脓毒症诱导的死亡病例有 70%发生于该阶段。脓毒症患者在临床症状消失之后仍处于长期的免疫免疫功能紊乱状态;表现为免疫抑制、持续的炎症、免疫麻痹、继发二次感染等。特别是细胞因子谱在脓毒症免疫抑制期间发生显著改变;而作为抑制性的细胞因子IL-4表达增高;且其表达水平与脓毒症患者死亡率高度相关;IL-4 可能参与了脓毒症介导的免疫抑制;具体作用及机制不清。因此;本课题主要探讨IL-4在脓毒症介导的免疫抑制中的作用及其机制。　　方法：通过CLP术建小鼠脓毒症模型;24h后经气管内滴注P.aeruginosa做肺部二次感染;以评价脓毒症免疫抑制状态。将WT小鼠和IL-4-/-小鼠建立二次感染模型;通过生存率实验、细菌载量的测定以及肺组织病理损伤检测等实验以明确IL-4在脓毒症中是否参与了脓毒症介导的免疫抑制;并用IL-4中和抗体及IL-4重组蛋白经生存率实验分别从正反两方面进行验证。然后进一步检测 WT 小鼠与IL-4-/-小鼠在二次感染期间的细胞因子及趋化因子水平变化;以及免疫细胞的数量及功能改变。经体外实验验证重组IL-4对中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞的吞噬杀菌功能的影响;以明确IL-4是否导致免疫细胞的免疫麻痹。进一步经Western B lo t技术阐明其相关信号通路。　　结果：脓毒症IL-4-/-小鼠能够抵抗P.aeruginosa引起的肺部二次感染。与WT小鼠相比;IL-4-/-小鼠在脓毒症时表现为生存率显著提高;且肺部细菌载量降低。进一步研究发现;脓毒症 IL-4-/-小鼠肺部的炎症应答增强;肺泡内中性粒细胞募集增多;肺内细胞因子（如 TNF-α）产生显著增加;中和 TNF-α 能够抑制 IL-4-/-小鼠在脓毒症二次感染期间表现出来的保护作用;提示IL-4缺陷所产生的保护作用部分是由TNF-α所介导。此外;重组IL-4显著抑制了体外培养的肺泡巨噬细胞对 P.aeruginosa 的吞噬和杀伤能力。进一步研究发现;这与 IL-4 抑制了巨噬细胞内信号分子 Akt、JNK、p38MAPK、和 Erk1/2 的磷酸化有关。最后;通过anti-IL-4 中和抗体中和 WT 小鼠体内的 IL-4 也能显著提高脓毒症小鼠在P.aeruginosa二次感染中的生存率;降低肺部的细菌载量。　　结论：IL-4 在脓毒症期间通过抑制中性粒细胞的募集和巨噬细胞的吞噬杀菌功能以及抑制炎症细胞因子而介导了脓毒症诱导的免疫抑制。敲除IL-4基因或用抗体中和IL-4能够部分解除脓毒症诱导的免疫抑制;显著提高脓毒症小鼠的生存率。本研究为我们在脓毒症的治疗方面开辟了一个新的思路。