论文部分内容阅读
紫色类鹑斑q-lp和褐色类鹑斑q-lb均是从素蚕品种发现的色素沉积突变体，表型与鹑斑q相似，但与q并不是同一个基因控制的。遗传分析表明控制两种突变体突变性状的基因是等位基因，且q-lb相对于q-lp为显性。图位克隆将两种类鹑斑突变体的突变基因定位到了家蚕第8连锁群，且q-lp的突变基因是orcokinin(OK)基因，一个单碱基的缺失引起orcokinin的两个转录本翻译提前终止，致使orcokinin功能完全丧失。orcokinin基因是节肢动物门所特有的一种神经肽基因，最早在利莫斯螯虾（Orconecteslimosus）中发现，因其具有向肌性而命名为orcokinin，2004年首次在昆虫中发现，目前发现orcokinin可能有控制生物节律、调控蜕皮激素信号通路等功能，然而其作用机理尚不清楚，甚至目前没有鉴定到一个orcokinin的受体。在此基础上，本研究首先明确q-lb的突变基因也是orcokinin，然后分析家蚕orcokinin(BmOK)基因的结构与表达情况，进而分析研究BmOK基因的功能，通过转录组和蛋白质组分析野生型与类鹑斑突变体之间的差异表达的基因和差异表达的蛋白质，并分析这些基因和蛋白质在类鹑斑突变体中扮演的角色，从而为阐述类鹑斑突变性状形成机制提供实验依据。主要研究结果如下： 第一，证明了q-lb的突变基因也是orcokinin基因。两个转录本BmOKA和BmOKB在q-lb中的表达量显著下调，BmOKB的mRNA结构并未发生变化，但是BmOKA的mRNA第5外显子完全缺失（q-lb_type1,80%），部分mRNA出现第4、5外显子同时缺失（q-lb_type2,20%），分析基因组发现在q-lb中BmOKA基因第5外显子内部插入大约4.3 kb的大片段，插入片段两端有一个11 bp的正向重复序列，因此判断该插入片段可能是一个转座子。 第二，分析了BmOK基因的结构与表达谱。BmOK基因存在选择性剪接，主要剪接形成BmOKA和BmOKB两个转录本，其中BmOKA又存在不同的剪接，exon4的5’端和exon6的3’端分别存在一个30 bp和36 bp的序列被随机剪接到mRNA中，导致BmOKA存在4种亚型BmOKA1、BmOKA2、BmOKA3和BmOKA4，4种亚型的占比为22∶13∶5∶1。RACE结果显示BmOKA和BmOKB共用5’UTR(62 bp)，4种亚型ORF分别为534 bp，564 bp，570 bp和600 bp，有单独的3’UTR(188 bp)，BmOKB的ORF为864 bp，有单独的3’UTR(168 bp)。BmOKA主要在腹神经索表达，在腹神经索中4龄眠后18小时表达量最低，BmOKB在头部和中肠的表达量相对较高，眠期表达量高于其他时期。BmOKA与斜纹夜蛾orcokinin同源性最高，完整蛋白质前体的同源性为33.80%，C端形成成熟肽的区域同源性为80.57%。 第三，BmOK基因功能研究。q-lb的突变基因也是orcokinin基因，两种突变体互为证明，表明BmOK基因是引起类鹑斑突变性状的主效基因。由于BmOK基因是神经肽基因，起作用的是成熟肽，因此根据文献中对成熟肽的预测以及多肽组测定结果，在类鹑斑突变体4龄起蚕时皮下注射6种成熟肽，发现OKA_type2能回复两种类鹑斑突变体的斑纹突变，5龄起蚕时斑纹消失，与野生型无异，一方面证明了BmOK基因是引起类鹑斑突变体突变性状的主效基因，另一方面也首次证实OKA_type2能调控家蚕斑纹的形成。同时OKA_type5和OKB_type1两种成熟肽能显著提高q-lp的体重，能部分回复紫色类鹑斑发育异常表型，其中OKB的作用达到极显著水平，由此初步证明了BmOK基因能影响家蚕的生长发育。 第四，利用转录组和qRT-PCR分析了两种类鹑斑突变体眠期表皮相关基因的表达情况。结果发现，在q-lp中，三大色素类含量增加，q-lb中黑色素和蝶啶类色素含量增加，但是眼色素含量减少；在q-lp中，表皮蛋白和几丁质含量增加，q-lb中几丁质含量也增加；两种类鹑斑中相关核受体基因表达均上调，黑色素调控基因apt-like基因在两种突变体的新老表皮中均显著下调，猜测该基因在突变体色素沉积过程中起关键作用。 第五，对932VR和q-lp五龄第三天的脂肪体组织进行2-DE分析。在鉴定的差异表达的蛋白质中，发现家蚕醛糖还原酶基因BmAR与q-lp突变体的发育异常表型相关，qRT-PCR验证发现其在不同发育时期在脂肪体中的表达量始终是野生型显著高于突变型，RNAi证实该基因能影响家蚕发育，使家蚕体重减轻，AR主要催化葡萄糖向山梨醇的转化，因此测定了野生型与突变型血液中的山梨醇含量，发现山梨醇含量也是野生型显著高于突变型，因此证明了BmAR也能催化葡萄糖向山梨醇的转化，同时BmAR的下调表达可能是突变体q-lp发育异常的原因之一。 通过上述分析，我们不仅明确了类鹑斑突变体的控制基因，还明确了控制斑纹性状的成熟肽，同时也分析了突变体中色素代谢相关基因的表达情况，为进一步阐述类鹑斑形成机制提供了直接实验证据。