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雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞真核绿藻,因在强光、高温、高盐和氮饥饿等胁迫环境下大量积累虾青素而备受关注。但是,由于虾青素合成涉及的基因数目多、调控网络复杂,至今仍不清楚其分子调控机制。与此同时,新一代高通量测序技术的出现大大促进了转录组学的研究,且不受物种和是否存在参考基因组的限制,能够快速对复杂的基因调控网络进行研究。为了弄清雨生红球藻虾青素合成调控的分子机制,本研究拟对胁迫早期的雨生红球藻192.80进行转录组测序,通过数据分析了解胁迫早期基因表达的特点,挖掘参与基因表达调控的关键基因,从而初步解析虾青素合成的调控网络。具体研究内容及结果如下:(1)通过半定量RT-PCR对胁迫早期的雨生红球藻虾青素合成关键酶基因HpCrtR-B和Hpbkt1进行转录分析。在45 mM NaAC和550μmol/m2/s光照强度下胁迫1.5h,已能够检测到HpCrtR-B和Hpbkt1基因的转录,4h后能观察到藻细胞开始积累虾青素,表明雨生红球藻虾青素合成的调控发生在胁迫早期;(2)为了获得高质量的雨生红球藻192.80的总RNA,实验中比较了不同培养基、藻细胞破壁方式、提取方法等因素,获得最优的总RNA提取方法:22℃白炽灯连续光照条件(25μmol/m2/s)下,于MIX培养基培养至对数中后期,离心收集藻细胞后采用改良Trizol法提取总RNA;(3)提取胁迫早期的雨生红球藻192.80总RNA进行转录组测序,经过测序、拼接、注释,共获得309962820条clean reads,83869个unigenes,unigene序列的平均长度747bp。对转录组进行GO、KOG、KEEG功能分类,发现大量unigenes与蛋白质转运、催化过程、转录和翻译有关,表明在胁迫早期雨生红球藻细胞内代谢旺盛,积极响应胁迫。通过与植物转录因子数据库比对获得476个转录因子,包括AP2/EREBP,bHLH,bZIP,C2H2,MYB和WRKY等几大类转录因子家族,显示在胁迫早期的雨生红球藻产生了大量转录因子,参与基因表达调控及转录激活等活动;(4)数据分析获得4367个差异表达基因,其中上调表达的基因数为2050个,下调表达的基因数为2317个。经过荧光定量RT-PCR的验证,显示有75%的差异表达基因与转录组测序一致。GO和KEEG富集结果表明差异表达基因中有预测上调基因主要集中在催化功能和金属离子结合。下调基因主要集中在小分子代谢方面。同时,获得71个差异表达的转录因子,其中上调28个,主要与蛋白的催化功能相关;下调43个,与植物的抗逆性相关。在对差异表达转录因子进行的转录水平分析发现,转录因子对强光和醋酸钠胁迫的响应不一致,转录活性随时间变化而变化。其中,HpGNAT-1在醋酸钠胁迫6h后转录水平上升300倍,强光胁迫则上升了30倍;(5)最后,对高响应强光和醋酸钠胁迫的HpGNAT-1进行分子克隆及生物信息学分析。该基因开放阅读框长度为493bp,同源性分析表明HpGNAT-1可能为N-乙酰基转移酶(NAT)。该基因可翻译成163个氨基酸,等电点5.92,不存在信号肽和跨膜区,可能定位在细胞质。它可能存在4个α-螺旋,7个β-折叠,具有NAT家族保守结构域和RimI结构域,可能通过与辅酶A结合,并作用于核糖体蛋白S18亚基来对转录起调控作用。以上研究结果表明:在强光和醋酸钠胁迫早期,雨生红球藻通过信号传导、转录激活、催化等生物过程积极响应胁迫,大量与之相关的基因转录活性上升,而小分子代谢则受到抑制。转录因子通过差异性响应强光和醋酸钠胁迫来对转录起调控作用。