研究背景：　　铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，也是全球非常重要的医院感染病原菌，据统计，人类感染的非发酵菌中，60％为铜绿假单胞菌感染。近年来，铜绿假单胞菌感染的持续高发，耐药情况的日趋严峻，部分抗生素耐药率的逐年上升，以及多重耐药和泛耐药的日益常见，均给临床治疗带来巨大的挑战。有关铜绿假单胞菌耐药机制的研究成为众多学者关注的热点，同时，因其耐药机制极其复杂，也成为当今研究的难点。　　超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是β-内酰胺酶中的一种，是一类可水解氧亚胺基β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，能导致对第三代头孢菌素如头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和单环类抗生素如氨曲南，甚至第四代头孢菌素如头孢吡肟和头孢匹罗的耐药。ESBLs在铜绿假单胞菌中的检出率越来越高，已经成为铜绿假单胞菌β-内酰胺类抗生素临床治疗效果下降的最主要原因之一。但是，一直以来铜绿假单胞菌的ESBLs检测存在争议，尚无标准、高效的检测方法，有关铜绿假单胞菌ESBLs携带情况、基因型别、流行情况等等尚缺乏详尽的数据。　　随着分子生物学技术、信息技术的发展，高通量测序技术应运而生。高通量测序技术，又称为下一代测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短为特点。高通量测序技术使人类获取基因组信息的方式发生了重大的变革，尤其适用于基因组较小的微生物领域的研究，已成为微生物鉴定分型、毒力分析、传播途径、耐药机制等方面研究的重要工具。　　本研究采用临床实验室标准化协会推荐的ESBLs表型确证试验，对本院可疑ESBLs阳性铜绿假单胞菌进行筛选，以多重 PCR方法对筛选阳性的结果进行耐药基因的检测，以了解我院铜绿假单胞菌ESBLs流行情况，并探讨铜绿假单胞菌的ESBLs不同检测方法间的优劣；然后，通过高通量测序技术实现对其中一株多重耐药菌株的全基因组测序，通过生物信息学分析，展开对铜绿假单胞菌的耐药机制、耐药基因环境等的研究。　　研究目的：　　了解广州医科大学附属第一医院临床分离的铜绿假单胞菌的耐药性及其超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的流行分布情况，深入分析铜绿假单胞菌的耐药基因环境，探讨其耐药的分子机制。　　研究方法：　　1、收集2011年1月至2012年6月广州医科大学附属第一医院微生物室分离出的铜绿假单胞菌，所有菌株用VITEK2微生物全自动鉴定仪进行鉴定和药敏实验，筛选头孢他啶耐药（MIC≥16ug/ml）的铜绿假单胞菌株，即可疑产ESBLs菌株，并对患者特点、病区分布、标本类型、药敏结果等资料进行统计，分析其流行病学特点。　　2、采用表型确证试验筛选产超广谱β-内酰胺酶的菌株，并对表型试验阳性菌株和表型试验阴性菌株的耐药率、多重耐药、泛耐药等情况进行统计学分析比较。　　3、采用多重 PCR技术对表型试验阳性菌株进行相关耐药基因检测，了解本院铜绿假单胞菌 ESBLs的主要基因型别，并探讨铜绿假单胞菌 ESBLs不同检测方法的优劣。　　4、用细菌 DNA纯化试剂盒提取多重耐药菌株 PA902的总 DNA，并用Illumina Miseq高通量测序仪进行测序。用Edena软件进行数据拼接，RAST网上工具进行基因注释，ResFinder和NCBI BLAST网上工具进行耐药基因分析， NCBI BLAST网上工具进行耐药基因遗传环境分析，PlasmidFinder网上工具进行质粒序列分析，MLST网上工具进行MLST分析。　　研究结果：　　1、111株头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌的流行病学分析和药敏结果分析2011年1月至2012年6月广州医科大学附属第一医院微生物室共分离出111株头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌。这些菌株分别来自于痰液63.9%（71/111）、胸水7.2%（8/111）、伤口分泌物7.2%（8/111）、尿液5.4%（6/111）、腹水4.5%（5/111）、血液3.6%（4/111）、其它标本类型5.4%（6/111）。患者年龄分布为：≥80岁20.7%（23/111）、70-79岁26.1%（29/111）、60-69岁13.5%（15/111）、50-59岁18.9%（21/111）、其它年龄20.7%（23/111）。患者病区分布为：重症医学科37.8%（42/111）、内科综合病区11.7%（13/111）、胸外科病区9.9%（11/111）、呼吸内科病区9.9%（11/111）、其它外科病区15.3%（17/111）、其它内科病区9.0%（10/111）、儿科0.9%（1/111）、外院5.4%（6/111）。111株头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌对11种抗生素的不敏感率如下：哌拉西林94.4%、哌拉西林-他唑巴坦90.8%、头孢吡肟81.1%、氨曲南91.9%、美罗培南72.7%、亚胺培南73%、庆大霉素55.9%、妥布霉素41.4%、阿米卡星31.5%、环丙沙星73%、左旋氧氟沙星66.7%。　　2、ESBLs表型确证试验结果分析111株头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌中超广谱β-内酰胺酶表型确证试验阳性菌株共23株，阳性率为20.7％；23株表型试验阳性菌株的药敏结果显示除阿米卡星外，对其它10种抗生素均呈现很高的耐药率；经SPSS17.0统计软件的 X2检验，23株产酶株对头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左旋氧氟沙星几种药物的耐药率显著高于88株非产酶株的耐药率，对哌拉西林、氨曲南、美罗培兰、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南耐药率均较高，无统计学差异；产酶株与非产酶株的多重耐药、泛耐药菌株比率经X2检验，结果显示产酶株的泛耐药菌株和全耐药菌株比率显著高于非产酶株。　　3、多重PCR检测ESBLs基因结果分析用多重PCR对23株表型试验阳性菌株进行检测，发现20株ESBLs基因检测阳性，其中19株为PER型，5株为TEM型，4株同时携带PER型和TEM型耐药基因，未检测出其它型别的ESBLs耐药基因。　　4、选取了一株多重耐药铜绿假单胞菌PA902，PCR法证实该菌株携带PER型ESBLs基因，对其进行高通量测序，共得到5,061,082条reads，预测基因组覆盖深度为198倍。通过数据过滤和拼接，共获得2693条contigs，最长contig长为60,157 bp，N50为19,105 bp，平均contig长度为2915 bp，GC含量为62.5%。　　5、对拼接后的数据研究发现，编码β-内酰胺酶的耐药基因有3个，包括blaOXA-10, blaPER-1和blaVIM-2，氨基糖苷类耐药基因发现了4个，分别为aph(3)-IId, aac(6)-Ib-cr, aacA4和aadA2，磺胺类耐药基因有1个，为sul1，四环素耐药基因有1个，为tetG；氯霉素耐药基因有1个，为floR。对染色体上的耐药基因研究发现，染色体携带突变的gyrA和parC基因，与喹诺酮耐药密切相关，另外还发现了多个与药物外排相关的耐药基因。　　6、对携带耐药基因的 contigs进行研究，发现 C401、C599、C651、C769和C1379等5个contigs携带可转移的耐药基因，并在这些contigs上面发现了1类和2类整合子的结构；对质粒序列的研究发现，基因组数据中存在一个可能与质粒复制相关的基因，11个与接合相关的基因，可能与多个耐药基因的转移有关。MLST研究发现该菌株属于 ST389，为首次发现携带 blaVIM-2和blaPER-1的ST389铜绿假单胞菌。　　结论：　　1、我院头孢他啶耐药铜绿假单胞菌感染以引起中老年、危重患者的呼吸道感染为主，对头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌，对常用多种抗生素耐药率高，多重耐药和泛耐药现象严重。　　2、表型确证实验检测我院头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌，产ESBLs菌株检出率为20.7%；产酶株和非产酶株对哌拉西林、氨曲南、美罗培兰、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南耐药率均较高，无统计学差异；产酶株对头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药率显著高于非产酶株，且产酶株的泛耐药菌株和全耐药菌株比率显著高于非产酶株。　　3、我院2011年至2012年6月临床分离的头孢他啶耐药铜绿假单胞菌产ESBLs以PER型最常见。　　4、高通量测序可快速、全面、准确地对耐药基因、基因环境和细菌分型等开展详细的分析，便于完成细菌耐药机制的研究。