天牛肠道碱性纤维素酶产生菌的研究

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纤维素是陆地上最主要的光合作用产物,由微生物产生的纤维素酶在纤维素的降解,特别是将固定碳变为大气中的CO2的过程中起了关键作用。碱性纤维素酶是纤维素酶组分中的一种,碱性纤维素酶只作用于纤维素分子中的非结晶区,而对结晶区几乎没有作用,随着造纸、洗涤剂等行业的发展,碱性纤维素酶越来越受到重视。   本研究通过富集培养、CMC平板初筛和摇瓶发酵复筛,从眉斑楔天牛肠道内筛选到一株产较强碱性纤维素酶能力较强的菌株,LB液体培养基培养初期细胞为短杆形,后期细胞呈圆球形,经革兰氏染色鉴定为阳性菌,经16SrDNA序列分析,初步鉴定为短状杆菌属,命名为Brachybacteriumsp.MBBJ4,进一步经G+Cmol%含量分析以及DNA-DNA杂交,判断该菌株为短状杆菌属一株新菌种。对该菌株所产碱性纤维素酶进行酶学性质的初步研究发现,该酶的最适pH值为8.5,对pH6.0-9.5具有很好的耐受性,最适酶反应温度为50℃,在30-60℃时表现出较好的稳定性,金属离子Ni2+、Cu2+、Mn2+、Sr2+、Ca2+、Co2+对纤维素酶酶活有促进作用,金属离子Fe2+、Zn2+、Mg2+对纤维素酶酶活有抑制作用,EDTA能够完全抑制其酶活。   采用响应面法首次对短状杆菌新菌株进行了发酵培养基优化,确定出最佳发酵条件后,通过单因素实验,确定培养基的最佳碳源为CMC-Na,氮源为蛋白胨以及各培养基成分的最优值;然后用Plackett-Burman法对7个培养基成分进行了评价,选出3个主要影响因素蛋白胨、K2HPO4·3H2O和NaCl做最陡爬坡试验,逼近最大产酶区域;最后通过Box-Behnken设计,利用Minitab软件进行回归分析,得到各因素的最佳水平。在优化的培养基条件下,碱性纤维素酶平均酶活为12.19U/mL,比优化前提高了45.64%。   碱性纤维素酶经Native-PAGE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量约为120kD,等电点电泳分析知pⅠ值为8.0,研究了饱和硫酸铵分级沉淀、丙酮沉淀法、等电点沉淀法三种浓缩方法对酶活的影响,结果显示硫酸铵沉淀得到的碱性纤维素酶酶活最高,当硫酸铵的饱和度为60%时,沉淀得到的碱性纤维素酶酶活最高。使用SephacylS-200预装柱对饱和硫酸铵沉淀法浓缩的粗酶液进行分离纯化,得到纯化的酶蛋白比活力为50.09U/mg,纯化倍数20.04,经SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量约为60kD。以CMC-Na为底物时,该酶的Km值为0.922g/L,Vmax为18.66mg/(L·min)。
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