电致化学发光传感器具有选择性好、灵敏度高、操作简单、易于便携、并且还易于实现微型化等优点,受到了广大研究者的关注。用适体作为电致化学发光传感器的识别元件构建的电致化学发光适体传感器是融合生物学、化学、物理学、信息科学及相关技术于一体,是目前发展十分活跃的研究领域。电致化学发光适体传感器中发光体系的选择和固载对于实现传感器的超灵敏监测,提高传感器的稳定性、选择性等都具有重要的意义。针对常用的电致化学发光信号探针金属钌配合物水溶性强、分子结构无官能团可共价交联而难于固载标记的缺点,本文利用纳米材料作为固载基质,用吸附、掺杂或堆积等方法来固载发光试剂,提高发光试剂的固载量,以增强发光效率；设计合成了含羧基的[Ru(phen)2(cpaphen)]2+配合物,通过共价键作用将共反应试剂与邻菲罗啉钌交联在一个分子内,得到自增强的发光试剂,从而提高其发光效率,用于构建电致化学发光适体传感器。本论文的研究工作主要分为以下几部分：1.基于DNA双链镶嵌[Ru(phen)3]2+功能化的空心金为标记构建信号增强的电致化学发光凝血酶适体传感器基于DNA链杂交反应形成超夹心结构用来固载发光试剂作为信号放大策略,结合空心金纳米颗粒大的比表面积、优良的导电性能等优点作为信号标签,构建电致化学发光适体传感器用于凝血酶的检测。在这里,空心金纳米颗粒由于具有大的比表面积以及好的导电性能用于标记凝血酶适体Ⅱ,然后用亲和素(SA)以封闭空心金纳米颗粒表面的特异性活性位点,这样就可以引入大量标记了生物素的DNA链(Bio-S1),在ssDNA 2 (S2)和ssDNA 3 (S3)存在时,这些部分互补配对DNA短链会自发的发生链杂交反应,形成超夹心的DNA双链,利用静电吸附作用,双链DNA可以固载大量的[Ru(phen)3]2+,从而加大了发光试剂的固载量,起到信号放大的作用。在目标物凝血酶存在的情况下,适体Ⅰ和适体Ⅱ可以通过夹心结构将适体11复合物固载到Au@Pb纳米复合材料修饰的电极表面,实现对凝血酶的检测。该方法利用超夹心结构固载[Ru(phen)3]2+,不仅解决了发光试剂[Ru(phen)3]2+不容易固载的缺点,又增加其固载量；同时利用空心纳米金的大的比表面积增加了DNA的固载量,进一步增加了发光试剂的固载量,从而放大了检测信号,提高了适体传感器的检测性能。结果显示,该适体传感器在5 fmol L-1至50 pmol L-1范围内对凝血酶有较好的线性响应,检测限为1.6 fmolL-1(S/N=3)。2.基于非共价键结合的[Ru(phen)3]2+@CNTs纳米复合材料作为信号探针在固态电致化学发光传感器的应用利用非共价键的π-π叠加作用制备了[Ru(phen)3]2+包裹碳纳米管([Ru(phen)3]2+@CNTs)纳米复合材料构建简单的无标记电致化学发光适体传感器用于检测凝血酶。在实验中,我们利用简单有效的π-π叠加作用将[Ru(phen)3]2+堆积在CNTs表面,制得了[Ru(phen)3]2+@CNTs纳米复合材料。然后利用Nafion好的成膜性作为[Ru(phen)3]2+@CNTs纳米复合材料分散剂,将其固定在玻碳电极表面做为电致化学发光信号探针。利用静电吸附作用将空心金纳米颗粒(HGNPs)吸附到电极表面用于固定凝血酶适体(TBA)。当传感器与目标物凝血酶孵育时,惰性的凝血酶蛋白通过适体的特异性选择作用组装到电极表面,由于蛋白的阻抗作用导致电致化学发光强度降低,从而可以检测凝血酶的浓度。实验结果显示,传感器的电致化学发光信号变化与凝血酶浓度的对数在20 nmol L-1到1 pmol L-1的范围内成线性关系,检出限达到033 pmol L-1。此外,我们用电子扫描显微镜以及紫外-可见分光光度计探讨了纳米材料成功制备的可能性。这项工作主要从发光试剂的固载方法上提供了新的方法,从而也扩展了CNTs的应用范围。3.基于钌(Ⅱ)联氨苄西林为识别元件构建ECL生物传感器用于β-内酰胺酶的检测在这项工作中,利用合成的含羧基支链的邻菲罗啉钌共价连接氨苄西林(Ru-Amp)作为新颖的特定的p-内酰胺酶识别元件,构造一个简单、灵敏的电致化学发光生物传感器测定p-内酰胺酶的浓度。在这里,Ru-Amp配合物不仅可以作为β-内酰胺酶特异性识别元件,同时又作为体系的发光物质。首先,我们用3-噻吩丙二酸(TA)还原的纳米金(TA@AuNPs)作为信号探针的固载基质,该纳米金材料表面不仅带有大量的负电荷,还具有π键结构,不仅可以通过静电吸附固载Ru-Amp配合物,还可以通过Ru-Amp分子的π键结构通过非共价键的π-π叠加作用结合起来,从而可以将大量的Ru-Amp固定到TA@AuNPs表面,得到的Ru-Amp/TA@AuNPs纳米复合材料。该纳米复合材料,不仅在试剂方面表现出优异的电致化学发光的行为,还在电极表面可以产生非常稳定的膜,容易实现固体电极的制备。当目标物β-内酰胺酶存在时,传感器的电致化学发光信号会明显增强,从而实现了对β-内酰胺酶的检测。该生物传感器对β-内酰胺酶的浓度变化范围从50 pg mL-1-100 ng mL-1,检测限为37 pgmL-’。该传感器为设计多样化的电致化学发光传感器提供了新的思路。4.p-内酰胺酶催化水解原位生成自增强发光物质用于构建凝血酶适体传感器基于β-内酰胺酶的水解催化原位生成自增强的发光试剂作为信号放大策略构建的超灵敏的电致化学发光适体传感器用于凝血酶的检测。首先,设计合成了一种新的发光试剂,该化合物包含两部分,一部分为发光试剂[Ru(phen)2(cpaphen)]2+,一部分为含氨基的氨苄西林(Amp),其可以对钌的发光起到一定的促进作用。将这两部分用N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙烯碳二亚胺-盐酸盐交联剂交联起来,得到[Ru(phen)2(cpaphen)]2+-Amp (Ru-Amp)配合物,其可以通过分子内的电子转移,从而促进整个分子的电致化学发光性能,也即自增强的发光试剂。然后利用非共价键的π-π叠加作用将R.u-Amp与碳纳米管结合在-起得到Ru-Amp@CNTs复合纳米材料,利用聚乙烯亚胺(PEI)作为交联剂将Ru-Amp@CNTs复合纳米材料连接在金纳米笼(AuNCs)表面,得到Ru-Amp@CNTs-AuNCs复合材料。最后利用Au-S键将适体Ⅱ(TBAⅡ)连接到Ru-Amp@CNTs-AuNCs复合材料上制备了适体Ⅱ的复合生物复合材料(Ru-Amp@CNTs-PEI-AuNCs-TBA Ⅱ)。在目标物凝血酶存在时,通过夹心结构,适体Ⅰ-凝血酶-适体Ⅱ的作用,将适体Ⅱ的复合生物材料固载到dpAu/Nafion-GR修饰的玻碳电极表面。当修饰电极孵育了β-内酰胺酶后,由于β-内酰胺酶对氨苄西林特异性的催化水解作用,将Ru-Amp中氨苄西林部分的酰胺基团打开生成了仲胺,生成的仲胺能够更进一步的通过分子内的电子转移促进钉的电致化学发光,得到了信号放大的凝血酶适体传感器。该传感器具有好的稳定性和灵敏度,在10 fmol L-1-1.0 pmol L-范围内检测凝血酶,检测下限为0.33fmol L1。由自增强的发光试剂结合酶催化放大技术构建传感器的方法有望在生物技术和临床应用上有一定的借鉴作用。5.基于水凝胶金纳米复合材料作为信号探针构建signal-on的凝血酶适体传感器基于自组装水凝胶金纳米复合材料(内含钌配合物的电致化学发光基团)作为信号探针,聚乙烯亚胺还原树枝状纳米金(PEI-DAuNPs)作为共反应试剂制备了灵敏的电致化学发光适体传感器用于检测凝血酶(TB)的浓度。首先用交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙烯碳二亚胺-盐酸盐将含氨基的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(NAMM)和含有-COOH基团的电致化学发光体[Ru(phen)2(cpaphen)]2+配合物交联起来,所得到的化合物具有电致化学发光特性,还可以作为水凝胶聚合反应的单体。另外,N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺还可以通过Au-N键与金纳米颗粒连接作为聚合物的另一单体。通过自由基聚合反应,得到了具有发光基团的自组装的水凝胶金纳米复合材料(pNAMM-Ru-HGNPs)。该水凝胶金纳米复合材料被用做载体有效的固载凝血酶适体1 (TBA Ⅱ)从而成功制备了水凝胶适体Ⅱ复合生物材料(pNAMM-Ru-HGNPs-TBA Ⅱ)。用聚乙烯亚胺还原纳米金是带正电荷的,其可以通过静电吸附固载在CNTs-Nf修饰电极上,不仅用于捕获凝血酶适体Ⅰ,还可以将共反应试剂固载在电极表面。最后在凝血酶存在的条件下,利用夹心模型,适体Ⅰ-凝血酶-适体Ⅱ的作用,将凝胶适体Ⅱ的复合生物材料固载到修饰电极表面,从而实现了对凝血酶的检测。利用聚合反应制备的水凝胶能够有效的固载更多的钌发光试剂,结合PEI-DAuNPs作为共反应试剂,在电极表面可以得到强的电致化学发光信号,提高了传感器的检测灵敏度。