硝基还原酶是一种对辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)以及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性的还原酶，本论文研究的硝基苯硝基还原酶(nitrobenzene nitroreductase，NN-BD-33)就是其中一种，它参与硝基苯的代谢，催化降解硝基苯成羟基苯胺，同时辅酶NADPH被氧化为NADP+。在常见的硝基苯硝基还原酶当中，NN-BD-33具有低Km值、基本无逆反应、较宽的热稳定性等优点，这些特性决定其在含硝基苯工业废水治理领域具有较高的应用价值和广阔的应用前景。　　 本论文从已报道的硝基苯硝基还原酶同源序列入手，以实验室保藏的若干细菌为靶标，通过分子生物学方法从Pandoraea sp.BD-33菌株中克隆到硝基苯硝基还原酶基因，构建硝基苯硝基还原酶基因重组表达质粒，通过诱导表达和亲和层析纯化，获得重组硝基苯硝基还原酶，进而研究了该硝基苯硝基还原酶的性质。　　 论文的主要研究成果如下：　　 1)从Pandoraea sp.BD-33菌株中克隆到硝基苯硝基还原酶全长基因并测序，得到792 bp的片段，该基因编码263个氨基酸残基序列。　　 2)将硝基苯硝基还原酶基因克隆后与表达质粒pET-28a(+)连接，成功构建硝基苯硝基还原酶重组质粒pET-28a-NB，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导后高效表达。　　 3)对重组硝基苯硝基还原酶进行Ni-NTA亲和层析纯化，获得了高纯度的酶液。纯化后的硝基苯硝基还原酶在SDS-PAGE中显示为单一的条带。通过与标准蛋白的比较计算，测定重组酶的分子量为29.24 kDa。　　 4)系统研究了重组硝基苯硝基还原酶的各项性质，包括最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性和稳态动力学研究。结果发现：重组酶的最适反应温度为40℃，在pH7.0的磷酸盐缓冲液中不同温度处理30min后，测定残余酶活力，结果发现重组酶在45℃以下稳定；重组酶的最适pH值为7.5，在不同pH条件下25℃处理1h后测定残余酶活，结果发现该酶在pH7.5处最稳定；重组酶对硝基苯的Km和Kcat分别是1.154±0.495μM和2.626±0.034 S-1，对NADPH的Km和Kcat分别是833.78±89.5μM和21.066±1.528 S-1。　　 这些研究为环境污染治理提供了可靠的数据支撑，为进一步深入研究该硝基苯硝基还原酶的催化机理及酶蛋白三维结构研究奠定基础。