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研究背景在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中,错配修复基因(mismatch repair,MMR)突变是林奇综合征(Lynch syndrome,LS)发病的主要原因。MMR基因突变可导致相应修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)表达缺失,基因复制过程中的错误得不到纠正,最终导致微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)的发生。MSI与LS关系密切,在CRC患者中检测到MSI的高度不稳定(high-level microsatellite instability,MSI-H)对LS有着重要的提示作用。研究显示,MSI存在于90%的LS和10%的散发性CRC,而且MSI-H CRC具有独特的临床病理特征和预后好的特点。MSI-H不仅是CRC患者预后的一个有益指标,而且对CRC的辅助化疗具有指导意义,MSI-H CRC对以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为基础的化疗并不敏感。研究显示,携带KRAS基因突变的微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)CRC患者预后比KRAS野生型差。KRAS蛋白是位于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)下游的信号分子,当KRAS基因突变可导致RAS/RAF/MAPK通路持续处于激活状态,失去对细胞生长的正常调控。30%—45%的CRC存在KRAS基因突变,其中2号外显子的12与13密码子突变频率最高。西妥昔单抗/帕尼单抗用于转移性CRC的抗EGFR靶向治疗效果显著,但是当KRAS基因存在突变时,CRC患者无法从抗EGFR中获益,因此CRC患者在接受抗EGFR治疗前,应行KRAS基因突变检测。目的本课题主要通过检测msi在散发性crc中的分布状况,分析msi-hcrc与微卫星低度不稳定(low-frequencymicrosatelliteinstability,msi-l)/msscrc的临床病理特征。同时应用荧光聚合酶链反应(polymerasechainreactions,pcr)和免疫组化(immunohistochemistry,ihc)两种方法检测crc患者的msi分型,比较分析两种方法检测msi分型的一致性,分析ihc检测msi分型的灵敏度和特异度,有助于建立msi检测常规合理的检测方法和流程。在明确msi分型的前提下,应用定量实时荧光pcr(quantitativereal-timepcr,qpcr)检测kras基因在crc的突变率,分析其与msi之间的相关性。方法随机选取2014年1月至2016年1月行crc手术切除治疗的crc患者的石蜡标本319例,将石蜡组织切成蜡卷用于dna提取,提取的dna用于msi分型与kras基因突变检测。将石蜡组织切成组织片,用ihc检测这319例肿瘤组织中mmr蛋白(mlh1、msh2、msh6和pms2)的表达情况,实验结果数据使用spss20统计学软件进行分析。结果1.msi分型在散发性crc中的分布:其中msi-h、msi-l和mss在散发性crc的发生率分别为11.9%、0.31%和87.8%。在5个贝斯塔遗传标记中,bat26与bat25位点同时改变的有37例,d2s123位点与d17s250位点的改变各11例,6例存在d5s346位点的改变,5个位点均存在改变的有3例。2.msi-hcrc具有独特的临床病理特征:msi-hcrc在年龄<50岁的患者的发生率较高(p<0.001),倾向发生于右半结肠(p<0.001),分化程度低(p=0.034),而且msi-hcrc不易发生淋巴结转移(p=0.001)。msi-h在粘液腺癌的发生率高(p=0.044),浸润深度多集中在t3/t4(p=0.010),并且在i/ii期的发生率高于iii/iv期(p=0.004)。多因素分析显示:msi-h与年龄、淋巴结转移、分化程度和肿瘤部位有关。3.散发性CRC中MSI分型与MMR蛋白表达具有较高的一致性,两种方法具有较高的一致率97.8%,Kappa=0.894。IHC法灵敏度为87.1%,特异度为99.3%,阳性预测值为94.4%,阴性预测值为98.2%。4.KRAS基因在CRC的突变率为43.9%,12号密码子与13密码子的突变率分别为34.8%和9.1%,最常见的突变位点是12密码子的C.34 G>A(19.4%)。5.KRAS基因突变在CRC中的临床病理特征:KRAS基因突变在女性患者的发生率高(P=0.001),倾向于发生远处转移的CRC患者(P=0.004),并且在病理分期III/IV期发生率高(P=0.002)。多因素分析显示:KRAS基因突变与性别和病理分期有关。6.KRAS基因在MSI CRC与MSS CRC的突变率没有统计学差异(P>0.05),KRAS基因12密码子在MSS CRC突变率高于MSI CRC,而13密码子在MSI CRC的突变率比12密码子高(P<0.001)。结论1.MSI-H在散发性CRC的发生率为11.9%,MSI-H具有独特的临床病理特征。2.MSI分型与MMR蛋白表达具有较高的一致性,IHC检测MSI分型具有较高的灵敏度和特异度。3.KRAS基因在CRC的突变率为43.9%,KRAS基因与女性、易发生远处转移和病理分期III/IV期等病理特征有关。4.KRAS基因在MSI CRC与MSS CRC的突变率没有统计学差异,12密码子在MSS CRC突变率高于MSI CRC。