目的:生物体内微量元素的化学形态分布对理解微量元素的营养学、毒理学及药理学机理是十分重要的。本研究初步建立一种基于电泳分离和同步辐射x荧光(SRXRF)分析技术的生物样品内微量元素的种态分析方法,并对定量分析做了初步探讨。将所建立的方法用于研究人肝癌及癌旁组织中金属蛋白的分布特征,为人肝蛋白组学研究提供金属蛋白分布信息。同时应用于研究汞矿区鱼体内金属蛋白的分布特点,对人类健康,环境保护具有重要的实际意义。研究的开展可以为微量元素的形态分析研究提供技术基础,拓宽现代核分析技术在生命科学研究领域中的应用。方法:1.在电泳凝胶制备时,加入等量的金属样品,改变其它基体成分的含量,用SRXRF测定凝胶中金属样品的荧光强度,研究不同含量的基体成分对金属样品X荧光检测结果的影响。2.人肝癌组织及癌旁组织蛋白提取液(上清液)用IEF分成不同pI的蛋白条带,经干胶处理后,用SRXRF测定蛋白条带内的金属含量得到人肝癌组织及癌旁组织的金属蛋白分布信息。3.鱼肝组织蛋白提取液(上清液)用IEF分成不同pI的蛋白条带,经干胶处理后,用SRXRF测定蛋白条带内的金属含量得到汞矿区鱼肝组织的金属蛋白分布信息。结果:1. SDS为12ul时,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量最大,大于或小于该值检测值均减小。随着Tris-Hcl的增加,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。随着丙烯酰胺的增加,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。随着甘油的增加,X荧光检测出Fe,Cu,Zn的相对含量依次减小。2.在所检出的含铁蛋白中,癌旁组织细胞胞质溶胶的pI为6.06、5.81、5.32、3.45、5.07的蛋白条带内含铁量明显高于癌组织,而癌组织样品中pI为5.94的条带内铁含量略高于癌旁组织;癌旁组织样品中铜含量高于癌组织则主要体现在pI为6.06、5.81的条带内;癌旁组织样品中锌含量高于癌组织主要体现在pI为6.06、5.32—6.19、5.07—6.44、5.32—6.06、4.32—5.81的蛋白条带内。3.在贵州草鱼1肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为4.94;在贵州草鱼2肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为5.05;在贵州鲤鱼肝上清液中,主要有1个含Zn条带,pI为4.82;在贵州鳙鱼肝上清液中,主要有2个含Zn条带,pI为4.94,5.17;在贵州草鱼2肝上清液中,主要含Hg条带为pI6.2,同时检测出高含量的As和Se;在贵州鳙鱼肝上清液中,主要含Hg条带为pI3.67,伴有高含量的As,同时也是主要的含Se条带;结论:1.等量的金属样品在不同的凝胶基体中X荧光检测出的相对含量是不同的,并且是有一定规律可循的,该结论为荧光强度和含量间关系的数学模型和基体校正程序的建立提供有意义的信息。2.肝细胞癌和癌旁组织的细胞胞质溶胶中,所检出的含铁、铜、锌蛋白基本是一致的,但金属在各个蛋白中的分布模式有所不同。MT与肿瘤的关系已引起人们广泛的重视,在pI4.32—6.44范围内癌旁组织样品中锌含量高于癌组织,已有报道MT在肝细胞癌中呈低表达,与我们的实验结果相类似。我们测得的主要含锌蛋白就可能是金属硫蛋白(MT)以及它们的聚合体。一些工作显示:肝癌组织中某些金属蛋白含量或活性反常如原发性肝细胞癌组织以及肝细胞瘤细胞系铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn.SOD)的活性与正常组织、癌旁组织以及正常肝细胞系相比有明显降低,说明肝癌细胞的抗氧化功能受到了严重的损害。癌旁组织pI为6.06,5.81、5.56、5.44的含锌蛋白同时铜含量也高于癌组织,应该是Cu/Zn.SOD,文献报道人肝Cu/Zn.SOD的pI为5.37、5.56和5.66。3.已有大量的报道表明硒对很多重金属,如砷、镉、汞、铅等的毒性具有拮抗作用,实验结果表明,高Hg鱼肝中Se同时增高,与以往的研究相符。另外,Hg蓄积时间长短不同,鱼种的差别和鱼体的营养状况等个体差异可能也是影响因素之一。还需要进一步加大样本量来获得更有力的证据。我们还发现Hg,As存在于同一等电点蛋白中,说明这两种元素具有某种相关性。这种相关关系不一定是因果关系,也可能仅是表面上的伴随关系。MT参与生物体内微量元素(Cu,Zn)的储存、运输和代谢和重金属(Cd,Hg)的解毒作用等多种生理功能。文献报道:各种亚型的MT结合不同数目的金属离子时,其pI3.36—5.57范围内。我们测得的贵州鱼肝上清液中主要含锌蛋白就可能是MT以及它们的聚合体。这有助于进一步研究汞与MT的关系及相互作用的机制。综上所述,SRXRF是一种高灵敏度,高分辨率的多元素分析方法,特别适合于电泳分离后生物样品中微量元素的形态分析。结果中这些分布特征的普遍性及生物学意义还有待进一步研究。