[背景]骨肉瘤(Osteosarcoma)是最常见的原发性骨的恶性肿瘤,又称为成骨肉瘤,经典骨肉瘤,成骨型肉瘤等,是一种起源于间叶组织,原发于髓内的高级别恶性肿瘤,其梭形基质细胞直接产生骨样基质,因而以肿瘤骨形成为主要特征。骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤。骨肉瘤恶性程度高,具有高度侵袭性,容易发生血运转移,易转移到肺,故骨肉瘤患者的预后极差。近年来,随着辅助化疗和辅助放疗的应用,骨肉瘤患者的生存率显著提高,达到了一个比较稳定的水平,手术方式逐步由截肢手术转为肿瘤假体保肢手术。目前,无转移的早期骨肉瘤患者经过手术和辅助化疗联合治疗后的五年生存率可达到60%左右。然而,骨肉瘤患者复发率极高,联合化疗并不能改善长期生存率。我们急需开发新的治疗方案。实体肿瘤增殖快,超过供养血管增生的速度,内部氧分压较正常组织明显为低,故实体肿瘤中普遍存在缺氧现象。缺氧不仅增强肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的耐受能力,还显著地促进肿瘤细胞的转移侵袭能力,使肿瘤细胞极易发生远处转移,使肿瘤快速进展。肿瘤细胞之所以适应周围缺氧微环境,主要是通过内源性基因表达的变化来实现。这些内源性基因中,最重要的是缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)。目前发现的有三种,分别为HIF-1α、HIF-2a和HIF-3α。HIF-1a和HIF-2a可调节1000多种靶基因,这些靶基因功能广泛,涉及细胞能量代谢、生长、凋亡、侵袭转移、血管生成和耐药等过程。尽管HIF-1α和HIF-2α蛋白在氨基酸序列上有48%的同源性,但是二者在基因调节方面的功能不尽相同。已有众多研究证明HIF-1α直接或间接参与调节许多肿瘤,尤其是恶性肿瘤发生发展的过程,然而,对于HIF-2α的作用则很少见诸报道。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种多功能血管生成因子,也是参与肿瘤血管生成最主要的调控因子。临床研究显示,VEGF,作为HIF的靶基因之一,在治疗后复发的骨肉瘤病例的血清和肿瘤组织中表达明显高于未复发者,其高表达预示着肺转移和较差的预后。ERK信号通路的主要途径是Ras激酶/Raf激酶/丝裂原细胞外激酶(mitogen extracellular kinase, MEK)/ERK通路,该通路是MAPKs (丝裂原活化蛋白激酶)家庭成员之一,在细胞信号通路网络中处于枢纽位置,是细胞外信号经细胞膜受体向细胞内传递的重要途径,该通路参与多种细胞生理过程,如细胞的生长、发育、分裂、分化和凋亡等。ERK在多重疾病发生发展过程中的重要作用。然而骨肉瘤细胞中HIF-2a与ERK的关系,国内外尚未见报道。Mcl-1(myeloid cell leukaemia-1)是Bcl-2家族成员之一,是一种抗凋亡蛋白。目前对Mcl-1的研究主要集中在其与肿瘤发生发展的关系,Mcl-1对恶性肿瘤的发生可能有着直接的促进作用。由于Mcl-1具有强烈的抗凋亡作用,Mcl-1有望成为治疗感染、炎症和恶性肿瘤等疾病的靶点。Knowles证实,在原发性骨肉瘤中,HIF-2a早于HIF-1a参与大多HIFs靶基因一如VEGF, Glut-1和PGK—的调节。并且,体外实验发现,骨肉瘤中HIF-1a和HIF-2a都参与调节了低氧环境细胞的增殖和迁移。RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种由内源性或外源性双链RNA(double-strand RNA, dsRNA)介导的、针对特异序列核苷酸片段的转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing, PTGS)或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失表型的现象,它也是体内抵御外在感染的一种重要的保护机制。本实验通过RNAi技术,利用已有的siRNA病毒作为载体,将针对HIF-2a的siRNA片段和阴性对照siRNA-scramble片段转染入人骨肉瘤MG-63细胞,以检测HIF-2a基因沉默对骨肉瘤细胞的生物学行为的影响。体外实验结果显示,HIF-2a基因沉默显著抑制低氧状态下的骨肉瘤细胞增殖、迁移和克隆集落形成,并且可下调VEGF、P-ERK/ERK和Mcl-1的表达水平。体内实验发现HIF-2a基因沉默显著抑制裸鼠皮下骨肉瘤的生长,进一步证实了HIF-2a基因沉默显著抑制骨肉瘤的发生发展。这表明HIF-2a与骨肉瘤的发生发展密切相关,有助于更好的理解HIF-2a在骨肉瘤低氧耐受及发展过程中的作用,并为开展针对HIF-2a的靶向治疗研究提供了实验依据。[目的]1.探讨低氧诱导因子-2a (HIF-2a)在骨肉瘤形成过程中的作用；2. HIF-2a基因沉默对低氧状态下骨肉瘤MG-63细胞的影响。[方法]1.低氧处理对MG-63细胞蛋白表达的影响低氧箱培养人骨肉瘤细胞MG-63,以模拟人体肿瘤内部低氧微环境,将实验组分为对照组和低氧组,对照组为常氧处理组,即低氧Oh。低氧组又分为6h组、12h组和24h组,分别低氧培养6h,12h和24h,然后以蛋白印迹实验(WesternBlot)检测骨肉瘤细胞MG-63的HIF-2α、VEGF、P-Erk/Erk和Mcl-1蛋白的表达水平,以评估这些蛋白表达与低氧处理时间的关系。2.小干扰RNA (siRNA)技术沉默HIF-2a基因分别用siRNA/HIF-2a病毒和阴性对照siRNA/scramble病毒感染MG-63细胞,获得MG-63/siHIF-2a (siHIF-2a)细胞和阴性对照MG-63/scramble(NC)细胞,荧光显微镜下观察绿荧光(GFP),以评估siRNA病毒是否感染成功,再利用流式细胞仪检测GFP表达率,以评估siRNA病毒感染效率,最后低氧培养MG-63细胞、siHIF-2a细胞和NC细胞24h,然后以蛋白印迹实验(Western Blot)检测3种细胞的HIF-2α蛋白的表达水平,评估siRNA技术对HIF-2α的沉默效率。3.基因沉默对低氧处理细胞蛋白表达的影响低氧培养MG-63细胞、NC细胞24h和siHIF-2a细胞24h,然后以WesternBlot检测3种细胞的VEGF、P-Erk/Erk和Mcl-1蛋白的表达水平,以评估这些蛋白表达与HIF-2a基因沉默之间的关系。4. HIF-2a基因沉默对MG-63细胞活性的影响于96孔板中分别种植siHIF-2a细胞和NC细胞(5000),分别低氧培养12h和24h,用MTT法检测OD值进行比较,以评估HIF-2a基因沉默对MG-63细胞低氧耐受力与细胞活性的影响。5. HIF-2a基因沉默对MG-63细胞迁移的影响siHIF-2a细胞和NC细胞铺满六孔板,贴壁后,以20μl枪头轻轻地在孔底划痕,换液,于Oh点显微镜下观察、拍照,低氧培养12h后在同样的地方观察、拍照。测量照片中的划痕宽度,换算成相对划痕宽度再进行比较,以评估HIF-2a基因沉默对MG-63细胞迁移的影响。6. HIF-2a基因沉默对MG-63细胞集落形成率的影响分别把siHIF-2a细胞和NC细胞以1000、2000、3000、4000和5000的数目均匀地种植入六孔板,低氧培养,每3天换一次液,3周后倒去培养基,以4%福尔马林固定细胞,结晶紫染色,显微镜下观察并计数,细胞团中的细胞数大于50个计为一个集落。比较两种细胞在各个细胞种植数目下克隆集落形成率,以评估HIF-2a基因沉默对MG-63细胞生长的长期影响。克隆集落形成率=(克隆集落形成数目/细胞种植数目)×100%。7. HIF-2a基因沉默对MG-63细胞在体内发生发展的影响分别培养siHIF-2a细胞和NC细胞,消化后制成细胞悬液,注射入裸鼠背部皮下,建立裸鼠皮下肿瘤移植模型,分别为siHIF-2a组和NC组,4周后处死裸鼠,取出肿瘤,称肿瘤的重量,测量肿瘤长短经,计算肿瘤体积。肿瘤体积=(长径×短径2)/2。比较NC组和siHIF-2a组皮下肿瘤重量、体积和密度,以评估HIF-2a基因沉默对MG-63细胞在体内发生发展的影响。[结果]1.常氧处理组(即低氧培养0h组),HIF-2a几乎不表达,随着低氧处理时间的延长,HIF-2α、VEGF、P-Erk/Erk和Mcl-1蛋白的表达也逐渐增加(F=2037.412, P<0.001; F=61.276, P<0.001; F=582.596, P<0.001; F=128.516,P<0.001)。2. siRNA病毒转染成功。荧光显微镜下可见到GFP表达,流式细胞术检测显示,多次传代后的MG-63/scramble (NC)细胞和MG-63/siHIF-2a (siHIF-2a)细胞的GFP表达率分别为(79.1±1.9)%和(82.7±2.1)%,二者没有显著性差异(P>0.05)。3. Western Blot检测结果显示,相对于NC细胞,siHIF-2a细胞的HIF-2α、 VEGF、P-Erk/Erk. Mcl-1表达水平均显著下降(F=817.462,P<0.001；F=87.098,P<0.001; F=58.672, P<0.001; F=1280.843, P<0.001)。4.MTT法检测显示,NC细胞和siHIF-2a细胞在12h的OD值分别是1.73±0.05和1.27±0.04(t=12.74,P=0.001),在24h的OD值分别是1.61±0.03和1.034±0.05(t=16.62,P<0.001)。二者在24h的差异更大。5.NC组和siHIF-2a组的在12h的相对划痕宽度分别为0.214±0.01和0.78±0.02(t==44.15,P<0.001)。6.当种植细胞数为1000、2000、3000、4000、5000时,siHIF-2a组和NC组的克隆集落形成率分别为1.02±0.15和2.57±0.25(t=9.208,P=0.0027)；1.17±0.27和2.75±0.18(t=8.433,P=0.0038)；1.35±0.22和2.76±0.28(t=6.858,P=0.0063)；1.444±0.19和2.93±0.39(t=5.949,P=0.0276)；1.98±0.27和3.91±0.40(t=6.927, P=0.0062), siHIF-2a组细胞克隆集落形成率均显著小于NC组。7.在体实验中,siHIF-2a组和NC组肿瘤形成的体积(cm3)、重量(g)和密度(g/cm3)分别为0.196±0.071和0.486±0.108(t=3.886,P=0.006)；0.049±0.009和0.384±0.108(t=5.354,P<0.001)；0.251±0.001和0.790±1.002(t=0.9317,P<0.001)。与NC组相比,siHIF-2a组形成肿瘤的体积、密度均小于NC组,差异具有统计学意义。[结论]1.低氧诱导HIF-2α、VEGF、P-Erk/Erk和Mcl-1蛋白的表达,且具有明显的时间正相关性；2. siRNA-HIF-2a转染后,siRNA-HIF-2a和siRNA-scramble核苷酸序列表达稳定,感染效率较高；3. siRNA-HIF-2a转染后,可显著减少低氧培养细胞HIF-2a蛋白的表达,说明siRNA-HIF-2a对HIF-2a基因沉默效果好。另外,VEGF、P-Erk/Erk、Mcl-1蛋白的表达水平也受到明显抑制,说明HIF-2α很可能是调控这三个蛋白的上游基因,对它们的活性与表达具有显著的影响；4.HIF-2α基因沉默显著抑制MG-63细胞在低氧环境下的细胞活性；5. HIF-2a基因沉默显著抑制MG-63细胞在低氧环境下的迁移；6. HIF-2a基因沉默显著抑制MG-63细胞在低氧环境下的克隆集落形成率；7. HIF-2a基因沉默显著抑制骨肉瘤在体内发生发展的过程。