论文部分内容阅读
目的:基于课题组前期实验发现益肺散结方可减轻COPD小气道重塑及延缓肺纤维化进展的基础上,本课题进一步研究益肺散结方逐瘀作用的分子机制。本课题选取方中逐瘀药莪术的主要成分姜黄素、莪术醇干预人肺成纤维细胞,观察其对胶原合成及自噬水平的影响,探讨其是否通过调控自噬干预人肺成纤维细胞胶原合成,从而阐述益肺散结方逐瘀作用的分子机制,为临床应用提供实验依据和理论基础参考。方法:体外培养人肺成纤维细胞(HLF),以TGF-β1刺激成纤维细胞使之分化为肌成纤维细胞。不同浓度姜黄素、莪术醇为实验组。加入CQ的为抑制剂组。以雷帕霉素干预作为阳性对照组。为检测胶原合成,使用消化法羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒检测各组细胞的HYP含量;Q-PCR法检测纤维化相关基因α-SMA表达水平;使用Western Blot检测细胞内Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)表达情况;使用Elisa法检测Ⅰ型前胶原氨基端肽(PⅠNP)、III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、人脯氨酸羟化酶(PHD)的含量。为检测自噬水平,使用透射电镜观测自噬小体形成情况;Q-PCR法检测自噬相关基因Beclin1、ATG 7表达水平;Western Blot检测细胞内LC3B-Ⅱ蛋白、p62蛋白表达情况。结果:1.与模型组相比,不同浓度的姜黄素对TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞模型12h后的调节作用如下:1.1α-SMA的mRNA转录水平及HYP含量均有不同程度降低(P<0.05)。1.2 8μg/mL姜黄素组PⅠNP降低(P>0.05)。16μg/mL、32μg/mL的姜黄素组PⅠNP均有不同程度降低(P<0.05)。8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL的姜黄素干预后PIIINP降低(P<0.05)。8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL的姜黄素组PHD降低,仅8μg/mL、32μg/mL的姜黄素组的差异具有统计学意义(P<0.05)。32μg/mL的姜黄素组COL-Ⅰ、COL-Ⅲ合成水平均有不同程度降低,但是仅COL-Ⅰ差异具有统计学意义(P<0.05)。1.3自噬小体增多、Beclin1、LC3B、ATG7的mRNA转录情况均有不同程度升高,但是仅16μg/mL、32μg/mL的姜黄素组Beclin1的差异具有统计学意义(P<0.05);LC3B-Ⅱ蛋白表达增多(P<0.05);p62蛋白表达减少(P>0.05)。1.4在氯喹抑制自噬后,姜黄素干预组PⅠNP、PIIINP、PHD含量及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达仍有不同程度降低,但姜黄素的药效被削弱(P<0.05)。2.与模型组相比,不同浓度的莪术醇对TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞模型12h后的调节作用如下:2.1α-SMA的mRNA转录水平及HYP含量均有不同程度降低(P<0.05)。2.2 8μg/mL莪术醇组PⅠNP稍有降低(P>0.05)。16μg/mL、32μg/mL的莪术醇组PⅠNP均有不同程度降低(P<0.05)。8μg/mL、16μg/mL莪术醇组PIIINP稍有降低(P>0.05)。32μg/mL的莪术醇组PIIINP降低(P<0.05)。8μg/mL的莪术醇组PHD略有增高(P<0.05)。16μg/mL、32μg/mL莪术醇组PHD含量降低,(P>0.05)。32μg/mL的莪术醇组COL-Ⅰ、COL-Ⅲ合成水平均有不同程度降低,但是仅COL-Ⅲ的差异具有统计学意义(P<0.05)。2.3莪术醇促使自噬小体增多、Beclin1、LC3B、ATG7的mRNA转录情况均有不同程度升高,但是仅16μg/mL、32μg/mL的莪术醇组Beclin1的差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,LC3B-Ⅱ蛋白表达增多(P<0.05);p62蛋白表达减少(P>0.05)。2.4使用氯喹抑制自噬后,莪术醇干预组HYP含量及PⅠNP、PIIINP和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达量均较模型组下降,但莪术醇的药效被削弱。结论:1.莪术的主要成分姜黄素、莪术醇能减少HLF细胞α-SMA表达并降低HYP、PⅠ/IIINP、PHD、COL-Ⅰ/Ⅲ含量,具有降低HLF细胞胶原合成的作用。2.莪术的主要成分姜黄素、莪术醇可增加HLF细胞自噬小体形成,提高Beclin1、ATG 7表达水平增加,LC3B-Ⅱ蛋白表达,具有激活HLF细胞自噬的作用。3.莪术的主要成分姜黄素、莪术醇激活自噬可能是其减少HLF细胞胶原合成的机制之一。