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一、背景作为内源性非编码小RNA,Micro-RNA(miRNA)在细胞内发挥着广泛的调节作用。糖尿病是我国目前最主要的代谢性疾病,其中2型糖尿病(T2DM)占已确诊糖尿病患者的90%以上,且呈年轻化趋势,亟待持续深入的研究。研究发现,miRNA能够参与调控脂肪细胞分化,胰腺发育,β细胞分化,胰岛素生物合成,胰岛素分泌和信号传导,对2型糖尿病的发生、发展及并发症的出现起着重要的作用。因此鉴定新的与2型糖尿病相关的miRNA分子,并揭示其在2型糖尿病发生中的作用机制具有重要的研究价值。二、目的以T2DM患者和健康人群的外周血液作为研究对象,探究miR-149-5p在两组人群中的表达差异,分析其表达水平与糖尿病临床指标之间的相关性;利用生物信息学方法预测和体外细胞实验,筛选出miR-149-5p可能直接调控的靶基因,构建含有靶基因序列的重组质粒并进行双荧光素酶基因活性检测,验证miR-149-5p对靶基因的直接调控作用。使用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术,检测miR-149-5p水平变化对靶基因水平的影响。研究miR-149-5p对胰岛素信号通路,糖代谢通路,及脂代谢通路相关分子的影响,探究miR-149-5p在T2DM发生和发展中的作用。三、方法1.探究miRNA-149-5p水平与T2DM发生之间的关系a)采集初诊且未经治疗、无并发症的T2DM患者和相仿年龄的健康献血者的空腹外周血液,使用EDTA抗凝处理,置于-80℃冰箱保存。同时收集两组人群的临床生化检测数据及T2DM患者的病历资料。b)在血样中加入外参基因,使用Trizol法提取血液总RNA,加A尾反应使miRNA修饰上Poly(A)尾,逆转录反应得到miRNA的cDNA。c)利用荧光定量PCR技术鉴定两组人群中miRNA-149-5p表达水平的差异。利用miRNA-149-5p正向引物和反向通用引物扩增miRNA-149-5p分子,同时扩增外参基因作为对照,分析miRNA-149-5p分子水平在两组人群中的表达差异。d)利用两组人群的临床血液生化数据,分析miRNA-149-5p表达水平分别与空腹血糖水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、个体肥胖指数等糖尿病指标之间的相关性。2.筛选T2DM发展过程中miRNA-149-5p可能直接调控的靶基因。a)使用权威的miRNA靶基因预测软件:DIANATOOLS、miRDB和TargetScan,筛选可能受miRNA-149-5p调控且与T2DM发生相关的潜在靶基因b)在肝癌HepG2细胞分别中转染miRNA模拟物miRNA-149-5p agomir,miRNA拮抗剂miRNA-149-5p antagomirr,同时分别转染NC-agomir、NC-antagomir作为阴性对照。使用荧光定量PCR技术,以U6作为内参基因检测miRNA-149-5p在细胞中的表达水平。同时以actin作为内参基因检测过表达或干扰miRNA-149-5p后靶基因的表达情况。初步将表达水平变化明显的基因作为靶基因。c)分析靶基因mRNA的3’非翻译区域(3’utr区域),确定其可能与miRNA-149-5p结合的潜在区域。设计加入双酶切位点的引物,采用PCR方法扩增出编码靶基因3’utr区域的部分DNA片段,双酶切后克隆入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体;菌落PCR鉴定阳性克隆,测序确定载体是否构建成功。d)将空载体和重组载体分别与miRNA-149-5p-agomir或NC-agomir在HepG2细胞中进行共转染,转染后24小时进行双荧光素酶基因报告实验,检测不同组细胞荧光素酶活性的变化情况,在细胞内确定miRNA-149-5p对靶基因的直接调控作用。3.探究miRNA-149-5p对靶基因及胰岛素信号通路的影响a)利用荧光定量PCR技术分析miRNA-149-5p水平改变对靶基因的影响。针对胰岛素信号通路中关键分子AKT,IRS1,IRS2,设计特异性引物,检测在HepG2细胞中过表达或抑制miRNA-149-5p对其转录水平的影响。b)利用蛋白免疫印迹技术,进一步验证过表达或抑制miRNA-149-5P后对靶基因蛋白表达水平,以及AKT磷酸化水平的影响。四、结果1.miRNA-149-5p在正常和T2DM人群中的表达差异:荧光定量PCR结果显示,miRNA-149-5p分子在T2DM患者中呈异常高表达,升高达1.3倍左右。进一步分析显示,miRNA-149-5p分子水平与两组人群的空腹血糖水平以及BMI指数呈正相关,但与高低密度脂蛋白,甘油三酯水平、总胆固醇水平无明显相关性。2.初步筛选miRNA-149-5p-3p的潜在靶基因:利用生物信息学分析,初步筛选出12个与T2DM发生相关且可能受到miRNA-149-5p调控的潜在靶基因。3.过表达和抑制miRNA-149-5p后对靶基因的影响:在HepG2细胞中转染miRNA-149-5p Agomir或Antagomir后发现,miRNA-149-5p在细胞中过量表达550倍左右。在HepG2细胞中转染miRNA-149-5p antagomir后发现,miRNA-149-5p在细胞中过量表达略有降低。过表达miRNA-149-5p能够抑制靶基因IGFBP5的表达水平,相反,干扰内源性miRNA-149-5p能够上调IGFBP5的表达水平。4.靶基因重组载体的构建:生物信息学分析显示,IGFBP5 m RNA的3’utr区域含有多个与miRNA-149-5p种子区潜在结合的位点。利用分子克隆的方法,将编码IGFBP53’utr区域的DNA片段克隆入pmirGLO载体,测序结果显示重组质粒构建成功。5.双荧光素酶报告基因实验确定miRNA-149-5p对靶基因的直接调控作用:共转染后的双荧光素酶报告基因实验显示,相较于阴性对照组,IGFBP5的重组载体与miRNA-149-5p激动剂共转染后荧光素酶活性出现下降(p<0.05)。6.确定miRNA-149-5p对胰岛素信号通路相关基因和蛋白表达的影响:RT-PCR结果显示过表达miR-149-5p后IRS,IRS2,AKT表达量出现下降(p<0.01);抑制miR-149-5p后IRS,IRS2,AKT表达量出现上升(p<0.01);Western Blot进一步证实,抑制HepG2细胞中的miRNA149-5p能够上调AKT蛋白的磷酸化水平(p<0.05)。五、结论1.miRNA-149-5p在T2DM患者的血液中呈异常高表达,且miRNA-149-5p分子水平与多个糖尿病指标呈显著相关性。2.IGFBP5可能是miRNA-149-5p直接作用的靶基因,过量表达的miRNA-149-5p可能通过抑制IGFBP5表达参与T2DM的发生。3.miRNA-149-5p过表达致使胰岛素信号通路的中重要分子IRS1,IRS2,AKT表达下降,而抑制miRNA-149-5p会使其表达水平明细升高,并升高AKT蛋白的磷酸化水平。