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研究背景：近年来由于抗菌药物广泛使用导致耐药致病菌迅速增加,碳青酶烯类抗生素耐药率也在逐渐增加。碳青酶烯类抗生素耐药的主要机制有：细菌能产β-内酰胺酶水解碳青酶烯类药物,各种细菌胞膜对药物的通透性降低以及细菌青霉素蛋白结合能力下降。碳青霉烯酶属于一类能水解亚胺培南及美罗培南的β-内酰胺酶,根据其Ambler分子结构的不同分为A、B、D三类酶,而B类酶属于金属酶MBLs,金属-β-内酰胺酶又称金属酶,能水解大部分抗生素,可被金属螯合剂抑制抑制。新德里金属-β-内酰胺酶-1[3](new nelhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)是碳青酶烯类酶的一种,其由基因blaNDM-1编码,几乎能水解所有的β-内酰胺类抗生素。全球首次于2008年报道了产NDM-1的肺炎克雷伯菌(KP05-506)和大肠埃希菌(NF-NDM-1),当时该两株菌分别来自两患者的尿液及粪便。随后产NDM-1耐药菌快速波扩散到全球各地,欧美许多国家相继出现了关于NDM-1的报道。而印度因为最早出现产NDM-1细菌而且出现的病例最多,所以被认为是NDM-1发源地。主要是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等革兰阴性菌能产NDM-1,其他细菌如产酸克雷伯杆菌、普罗威登斯菌等也有相应报道。自上世纪90年代以来,已发现的有NDM-1、SIM-1、SPM-1、 GIM-1、TMB-1、DIM-1、IMP、KHM-1、SPM-1和AIM-1等金属β-内酰胺酶,主要分布于革兰阴性菌中,各种耐药基因可通过质粒或整合子在不同细菌间水平扩散。自2010年以来我国就报道了有屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、臭鼻克雷伯菌等细菌能产NDM-1,而产NDM-1的阴沟肠杆菌未见报道。目前只有印度地区报道过产NDM-1阴沟肠杆菌的病例。本实验从我院一位住院患者中分离出国内第一株产NDM-1的阴沟肠杆菌,该患者是一名67岁的女性于2012年2月13日入院,病因是连续18天咳嗽咳痰；此病人还有冠心病、Ⅱ型糖尿病等病史；入院查体：端坐呼吸,双下肢轻度水肿,R 22次/分,双肺呼吸音低,体温36.2。C,气促,P100次/分,BP 135/96mmHg。胸部CT：左肺及右肺中下叶炎症。血常规：WBC 10.6×10~9/L, PCT 0.45 ng/ml, N 85.9%,。痰培养结果提示有阴沟肠杆菌生长。患者入院后,我们首先使用头孢唑肟钠2 g bid对其抗感染治疗,但持续两天患者并没有获得明显的治疗效果；血常规复查：WBC10.6×109/L,N81.9%。后更改使用莫西沙星400 mg qd加强治疗。病人接受此治疗八天之后病情得到明显缓解,血常规复查结果为WBC5.52×109/L,N 67.6%,；胸部CT：肺部的炎症减轻,其中最明显的是左下肺。因为病人情况好转,改用头孢哌酮舒巴坦钠3 g bid对其进行降阶治疗,病人八天之后不再有咳嗽咳痰,血常规复查：5.53×109/L,N70.7%,患者痊愈出院。此病人于2012年5月4日再次入院,病因是尿毒症、咳嗽、咳痰,但是血常规检查结果正常,痰液中无细菌生长；而其尿液中培养出大肠埃希菌,没有发现携带NDM-1基因,对碳青霉烯类敏感,也未在患者的尿液和粪便中检测到产NDM-1的细菌。经排查,该患者未曾到过印度或巴基斯坦等地旅游或工作。体外敏感试验显示：E. Cloacae 413对除外磷霉素与多粘菌素B几乎所有抗生素耐药。我们采用改良Hodge试验及亚胺培南-EDTA Etest试纸条协同试验证实分离出的阴沟肠杆菌产碳青酶烯类阳性,PCR可以从E. Cloacae413的DNA中扩增出blaNDM-1条带,扩增产物测序确认携带NDN-1基因。接合实验证实blaNDM-1可以随着质粒在E. Cloacae 413与接合子E. coli J53 (PNDM-1)细菌间转移,且该质粒大小约为20kb,脉冲场凝胶电泳显示此株阴沟肠杆菌为B型,Southern blotting结果还表明blaNDM-1存在于细菌染色体的250至300KB处。我们采用PCR法及BLAST比对法发现E. Cloacae 413同时还携带blaCTX-M-14, rmtA, qnrA, qnrB, aac6’-Ib-cr五种耐药基因,这些耐药基因也可通过结合试验将耐药性传递给受体菌,说明这些耐药基因可能同时位于同-质粒上。由于产NDM-1能导致细菌对几乎所有碳青酶烯类抗生素耐药,所以此株阴构肠杆菌的出现可能会导致耐药菌蔓延,对我们控制感染性疾病造成极大的影响,所以寻找此株产NDM-1的阴沟肠杆菌的来源及传播途径对我们控制细菌耐药性是很关键的。本文将重点探讨此株产NDM-1的阴沟肠杆菌的致病性及分析其基因序列特征。目的：分析产NDM-1的阴沟肠杆菌413的体外增殖能力、致病性、生物信息学分析以及耐药机制,从而探讨其耐药基因的可能来源及控制其可能的传播途径。方法：第一部分：用MTT法测定产NDM-1阴沟肠杆菌413与阴沟肠杆菌标准株4533的生长曲线并比较两株细菌的体外增殖能力,用小鼠腹膜炎模型测定检测产NDM-1阴沟肠杆菌413与阴沟肠杆菌标准株4533的毒力并比较两种菌株致病能力的大小。第二部分：对阴沟肠杆菌413进行全基因组测序和序列分析,并与其他产NDM-1菌株携带NDM-1质粒的序列进行生物信息学比对,分析耐药基因的可能来源及阴沟肠杆菌413遗传特征。结果：第一部分：同一浓度的阴沟肠杆菌413及阴沟肠杆菌标准株4533两株细菌增殖能力是不同,菌株413的增殖能力要强于标准株4533。413菌株的完全致死量和完全不致死量分别为109和104,而4533菌株的分别为1010和105；数据表明,413菌株的完全致死所需剂量明显小于4533菌株,而且完全不致死量的结果相似,413菌株的LD5o为4.27×107,4533菌株的LD5o为1.29×108。所以413菌株的的体外繁殖能力及毒力强于标准株4533。第二部分：本实验对E. cloacae 413细菌进行全基因组测序,明确了其基因轮廓；并构建群体系统发育树,阴沟肠杆菌413含NDM-1的质粒与不动杆菌PM131含NDM-1质粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1质粒、大肠杆菌PEC STM17含NDM-1质粒、阴沟肠杆菌菌株TP15含NDM-1质粒有较高的同源性,这提示阴沟肠杆菌413含NDM-1的质粒可能是由这些细菌之间平行传递的。然而耐药基因比对结果提示阴沟肠杆菌413含NDM-1的质粒所含耐药基因在不动杆菌PM131含NDM-1质粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1质粒、大肠杆菌PEC STM17含NDM-1质粒、阴沟肠杆菌菌株TP15含NDM-1质粒里均不存在,这提示可能NDM-1是通过基因片段的插入传递的,也有可能其他耐药基因在质粒传递过程中丢失或者药物选择作用出现了基因变异；最后解析了整个代谢通路和绝大部分基因的功能,从而发现产抗生素等次级代谢产物的整个调控网络和耐药相关基因的分布,从而为发现新的药物靶标并从基因组角度解释细菌耐药性、细菌与药物相互作用、细菌与宿主相适应性机制等提供新的思路。结论：产NDM-1阴沟肠杆菌E. cloacae 413的繁殖能力及侵袭力均强于阴沟肠杆菌标准株4533。阴沟肠杆菌413全基因测序及序列比对结果提示NDM-1的可能来源是通过基因片段的插入传递的,也有可能是质粒的传递或者药物选择作用出现了基因变异；最后解析了整个代谢通路和绝大部分基因的功能,从而发现产抗生素等次级代谢产物的整个调控网络和耐药相关基因的分布,从而为发现新的药物靶标并从基因组角度解释细菌耐药性、细菌与药物相互作用、细菌与宿主相适应性机制等提供新的思路。为我们加强耐药菌的监控及合理使用抗生素提供帮助。