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三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)已完成基因组测序,具备成熟的遗传转化技术,是海洋硅藻的模式种。由于其生长快、油脂含量高(占细胞干重的20％～50%),具备大规模培养的技术基础,已成为微藻生物柴油研究的理想材料。本文对其三酰基甘油(TAG)合成的关键基因进行了克隆,并在相应酵母缺陷型菌株中开展了功能验证,进一步构建了硅藻表达载体,完成了基因枪转化,取得进展如下: 1.通过RT-PCR方法从三角褐指藻总cDNA中克隆得到磷酸甘油酰基转移酶1(PtGPAT1)基因的完整cDNA序列,通过与基因组序列比较分析,发现该基因序列全长1947bp,编码648个氨基酸,基因组全序列共有5个外显子和4个内含子,利用信息学方法分析共有6个跨膜结构,分析该GPAT定位于内质网。 2.针对PtGPAT1与实验室之前克隆的二酰甘油酰基转移酶2基因(PtDGAT2),构建了酵母表达载体pYGPAT1与pYDGAT2,导入后分别在2株GPAT(Y13037、Y15983)和1株DGAT(H1246)缺陷型酵母菌株中进行相关基因的功能验证。尼罗红染色观察显示,PtGPAT1在2种酵母缺陷型转化子中的相对荧光值均显著高于转化空白载体的对照组,证明PtGPAT1重组表达蛋白具备磷酸甘油酰基转移酶活性。而PtDGAT2不能使DGAT缺陷性酿酒酵母H1246回复突变,提示不具备二酰甘油酰基转移酶功能。 3.针对PtDGAT2与实验室之前在酵母中已验证功能的二酰甘油酰基转移酶4(PtDGAT4),构建了硅藻表达载体pfcpA-DGAT2/pfcpB-Bar和pfcpA-DGAT4/pfcpB-Bar,并完成了基因枪转化,后续抗性藻株的筛选与检测实验正在进行中。 本文首次对三角褐指藻的GPAT基因完成功能验证,相对荧光值半定量结果显示,PtGPAT1可以显著提高酵母缺陷型菌株中的TAG含量,提示PtGPAT1可以作为三角褐指藻油脂代谢基因工程的重要靶基因。构建了PtDGAT2与PtDGAT4的硅藻转化载体,为进一步基因功能验证和硅藻油脂代谢基因工程奠定了必要基础。