研究背景：　　慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）和肺癌（Lungcancer，LC）是呼吸系统常见的两种疾病。最新数据显示我国40岁以上人群COPD的患病率已达8.2％，在我国部分地区已位居居民死因第四位。肺癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居于癌症首位。最新的世界卫生组织报告显示我国肺癌男女发病率均位于世界前列，且女性发病率（21.3/10万）明显高于欧美等发达国家。近几十年来，随着我国工业化、城市化进程加快所带来的各种环境污染问题的加剧，COPD与肺癌的发病率与死亡率也急剧上升，已成为当前威胁我国居民生存健康的主要疾病之一。　　COPD与肺癌关系密切，既往大量流行病学研究表明两者具有共同的环境暴露，如吸烟、大气污染、生物燃料使用、肺部感染等。其中，吸烟是两者最主要的共同环境病因，研究表明60%以上COPD和90%肺癌的发病都与吸烟相关，但仅有20-30%的吸烟者会患COPD，10-15%的吸烟者会患肺癌，提示个体易感因素在两者的发病过程中起着决定性的作用。近年来，遗传易感因素与COPD和肺癌发生发展的关联被广泛报道，多个人群关联研究尤其是全基因组关联研究（GWAS）报道了多个疾病易感位点。我们通过比对肺癌、肺功能和COPD的全基因组关联研究（GWAS），发现两者的易感基因在人染色体上定位基本是重叠的。COPD与肺癌的病因谱和易感基因的存在广泛重叠，表明COPD与肺癌可能存在共同的发病机制。　　炎症反应被认为是COPD和肺癌的共同发病机制。烟草等环境毒物能够刺激肺部的炎症反应，引起炎症相关分子如核转录因子-kappaB(NucleartranscriptionfactorkappaB，NFκB)等的异常激活，导致免疫反应异常等一系列机体反应，最终促进COPD或肺癌的发病。同时，COPD还可使肺部长期处于炎症状态和诱发肺基质重构，促进肺部癌前病变的发生，增加肺癌的发病危险。NFκB是机体细胞内调控炎症反应的核心分子，其内源性抑制物-核转录因子kappaB抑制蛋白（InhibitorofnucleartranscriptionfactorkappaB，NFKBI，又称IκB）可抑制其活性，NFκB与IκB的平衡是机体调控炎症最有效的手段。研究发现COPD和肺癌的发病过程中皆存在NFκB异常活化和高表达现象，且在重度吸烟者，COPD患者和肺癌患者中NFκB的表达水平同样明显高于正常人。提示NFκB的异常活化可能是COPD和肺癌发病的共同机制。　　NFκB家族有五个成员，包括：p105/p50，p52/p100，p65/RelA，c-Rel和RelB。在哺乳动物中，p105/p50和p52/p100这两种蛋白分别由NFκB1和NFκB2基因编码，最主要的二聚体是p50和p65/RelA亚单位。在静息细胞中，NFκB可被其抑制蛋白（IκB蛋白家族）隔绝而失活，在IκB蛋白家族中最普遍存在的是IκBα。前期关联研究报道了多个位于NFκB1、NFκB2和IκBα基因的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)[例如NFκB1基因(-94del>insATTG)，IκBα基因(-826C>T，2758G>A)等]可影响其基因的功能，从而与多种疾病发病相关，包括炎症性疾病（如坏死性小肠结肠炎、酒精性肝硬化等）、自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、多发性硬化病、白塞氏病等）和恶性肿瘤（如肝癌、前列腺癌、结直肠癌等）。NFκB/IκB与COPD和肺癌发病密切相关，上述遗传变异极有可能改变基因的功能，影响肺部的炎症状态，从而影响COPD和肺癌的发生发展，因此，本课题拟通过广州和苏州两个人群的研究探讨NFκB/IκB基因的遗传变异与COPD和肺癌发病的关联，并通过功能实验阐述其影响疾病发生的分子机制。　　科学假说：　　环境因素可通过激活NFκB信号通路，从而调节细胞凋亡、炎症反应和肿瘤发生。NFκB1、NFκB2和IκBα是人类NFκB信号通路最常见的核心分子，前期研究已报道NFκB1、NFκB2和IκBα基因上的功能性多态与多个疾病发病相关，因此我们提出NFκB1、NFκB2和IκBα三个基因的遗传变异可能会改变其基因功能，从而影响人群COPD和肺癌发病风险性的研究假说。　　研究目的：　　探讨NFκB/IκB基因4个潜在功能性SNP[NFκB1基因(-94del>insATTG)，NFκB2基因(-2966G>A)和IκBα基因(-826C>T，2758G>A)]与COPD和肺癌发病的关联；分析基因-基因以及基因-环境交互作用对COPD和肺癌发病中的影响，揭示上述遗传变异的生物学实质，以探索COPD和肺癌的共同易感机制，为COPD和肺癌的预防、诊断、治疗提供科学依据。　　研究方法：　　本研究采用双中心病例-对照研究，在广州和苏州这两个地区开展，分别在广州人群和苏州人群中收集病例和对照。其中，广州人群中收集的研究对象包括1025例COPD病例，1056例肺癌病例和1061例健康正常对照；苏州人群中收集的研究对象包括486例COPD病例，503肺癌病例和616健康正常对照。调查员先经培训合格后参与调查，通过询问研究对象，记录人口学基本特征和环境变量，包括吸烟、饮酒、既往史、家族史、职业史等。调查后填写调查表，并在调查表上签名。经签署知情同意书后，病例和对照皆采集外周静脉血5ml，并提取DNA进行后续分子流行病学检测。另外，2002年至2010年期间在广州地区3个社区开展了长期的COPD随访，每年对这些研究对象进行肺功能检测，已收集116例COPD患者和357例健康人的肺功能4年随访资料。　　在以往的研究中，对NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遗传变异与人群疾病发病的关联进行了探讨。其中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)，NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)，IκBα基因-826C>T(rs2233406)和2758G>A(rs696)四个位点的单核苷酸多态性被报道与多个疾病发病相关，并且-94del>insATTG，2758G>A这两个位点已被证实为功能性位点。因此，本研究我们拟从上述4个遗传变异位点出发，分析NFκB1、NFκB2和IκBα基因的遗传变异与COPD和肺癌易感性的关联，阐述COPD和肺癌的共同发病机制。　　运用Taqman法检测两个地区的病例和对照四个多态性位点的基因型。由于-94del>insATTG变异的生物学功能已经被证实，我们重点分析2758G>A多态性的生物学功能。采用Real-timePCR方法检测肺癌组织和癌旁组织中IκBα的mRNA水平，采用Westernblotting方法检测肺癌组织和癌旁组织中IκBα的蛋白质水平，采用免疫组织化学法检测IκBα在肺癌组织中的原位表达水平。　　通过生物信息学分析发现，IκBα基因2758G>A变异可能会影响miR-449a和miR-34b与IκBα基因3’非翻译区3’-UTR结合的能力，所以我们利用体外实验荧光素酶基因报告系统，分析在未经任何microRNA干扰下IκBα基因的表达，采用real-timePCR方法检测在有效microRNA干扰下，A549(2758GG基因型)和NCI-520(2758AG基因型)细胞系中IκBα基因的表达。　　运用卡方检验和t检验分析病例组和对照组在性别、年龄、吸烟、饮酒、既往史等人口学特征的差异。运用单因素非条件logistic回归模型，分析每个单核苷酸多态性位点与疾病发生的危险性关联，采用相乘交互作用模型分析环境-基因交互作用的可能性。在分层分析中，采用Breslow-Day检验各层样本的同质性。利用PS软件计算统计效能。分别运用单因素方差分析、Student’st检验和线性回归模型，分析不同NFκB1基因型人群的肺功能值、每年的第一秒用力呼气容积（Forcedexpiratoryvolumein1second，FEV1）下降值的差异，不同IκBα基因型的IκBαmRNA水平和蛋白表达的差异。采用Student’st检验分析含不同等位基因的质粒中的luciferase报告基因表达水平的差异。应用SAS9.13软件进行分析，所有的检验均为双侧检验，检验水准为α=0.05，P<0.05被认为差异有统计学意义。　　结果：　　在对照组中，NFκB1基因-94del>insATTG(rs28362491)；NFκB2基因-2966G>A(rs12769316)；IκBα基因-826C>T(rs2233406)和IκBα基因2758G>A(rs696)四个位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡，说明对照组符合随机人群分布的标准。　　在广州人群中，多态性位点-94del>insATTG与COPD发病有关联(P<0.05)，多态性位点2758G>A与肺癌发病有关联(P<0.05)。以携带del/del基因型的个体为参照，-94ins变异基因型(ins/ins+ins/del)的携带者发生COPD的危险性是del/del基因型携带者的1.23倍(OR=1.23；95%CI=1.03-1.54；P=0.037)。但在肺癌组中没有发现这种现象。与2758GA+GG基因型携带者相比，2758AA基因型携带者罹患肺癌的危险性是2758GA+GG基因型携带者的1.61倍(OR=1.61；95%CI=1.31-1.96；P=0.000)。此外，我们既未发现-2966G>A和-826C>T这两个多态性位点与COPD发病风险的关联，也未发现这两个多态性位点与肺癌发病风险的关联。　　在苏州人群中，我们进一步验证了上述阳性关联位点，得出的结果与广州人群中的结果一致。在苏州人群中，多态性位点-94del>insATTG与COPD发病风险有关联(P<0.05)，多态性位点2758G>A和肺癌发病风险有关联(P<0.05)。以携带del/del基因型者为参照，携带-94ins变异基因型(ins/ins+ins/del)者COPD发病风险是携带del/del基因型者的1.33倍(OR=1.33；95%CI=1.04-1.81；P=0.047)，而-94ins基因型与肺癌发病风险无关联(OR=1.13；95%CI=0.84-1.53；P=0.417)。以携带2758GG/AG基因型者为参照，2758AA基因型携带者罹患肺癌的危险性是2758GG/AG基因型携带者的1.69倍(OR=1.69；95%CI=1.27-2.25；P=0.003)，但未发现其与COPD的发病风险有关联。　　经同质性检验，我们发现广州人群和苏州人群研究结果具有同质性(Breslow-Daytest，NFκB1基因-94del>insATTG：P=0.734；IκBα基因2758G>A：P=0.941)，我们合并了广州人群和苏州人群数据以提高统计效能，结果显示携带-94ins变异基因型(ins/ins+ins/del)的个体罹患COPD危险性是携带del/del基因型个体的1.27倍(OR=1.27；95%CI=1.06-1.52；P=0.009)。而携带2758AA基因型个体患肺癌风险是携带其他基因型个体的1.63倍(OR=1.63，95%CI=1.39-1.92；P=0.000)。　　COPD是肺癌发病的危险因素，携带危险基因型的COPD病例发生肺癌的危险性可能会更高。因此，我们进一步分析发现在前期罹患COPD且携带2758AA或-94ins危险基因型的人发生肺癌的风险皆显著增加(2758AA：OR=1.68，95%CI=1.23-2.28; P=0.001;-94insATTG：OR=1.50，95%CI=1.01-2.21;P=0.043但在前期未催患COPD的患者中，-94ins变异基因型对肺癌发生的风险性影响不明显。联合这两个基因型分析发现，以前期未催患COPD的个体为参照，携带一个或两个危险基因型的前期催患COPD的患者催患肺癌的危险性更高，OR值更高，特别是在携带两种危险基因型的COPD患者中，肺癌发病风险更高(OR=2.52,95%CI=1.52-4.18;P=0.000)。　　我们分析NFκB1基因型对肺功能的影响时，发现携带-94ins ATTG变异基因型的COPD患者，使用支气管扩张剂前的FEV1值明显低于携带-94de1/del ATTG基因型的COPD患者(方差分析P=0.004;t检验P=0.002)。在对照组中，与携带其他基因型者相比，携带-94ins ATTG基因型者的吸入支气管扩张剂后的FEV1占预计值百分比较低(t检验P=0.021)。但是，无论是COPD病例组，还是对照组，均未发现IκBα基因的两个多态性位点基因型与肺功能值之间的关联。　　通过线性回归分析发现，-94ins/del ATTG多态性位点基因型与吸入支气管扩张剂前的FEV1值每年下降趋势有关(-94ins/ins ATTG：n= 62，-0.126±0.113L，-94ins/delATTG：n= 42，-0.091±0.083L，-94de1/del ATTG：n=12，-0.040±0.036L，方差分析P=0.015，线性回归分析P=0.017)。进一步分析发现，-94de1>ins ATTG多态性与COPD病情进展有关联，与COPD严重程度Gold分级有关联(p=0.048)。但未发现IκBα基因单核苷酸多态性与肺功能值变化之间的关联。　　我们发现，肺癌组织IκBα基因的mRNA表达水平明显低于癌旁组织(t检验P=0.032)，提示IκBα可能起到抑制肿瘤的作用。进一步研究发现，携带2758AA基因型的患者IκBα的mRNA水平在肺癌组织(方差分析P=0.001，线性回归分析P=0.008)和癌旁组织(方差分析P=0.002，线性回归分析P=0.004)中携带2758GG或AG基因型的患者。IκBα蛋白表达检测进一步确证了上述结果。另外，免疫组织化学法检测发现，携带2758AA基因型患者肺癌组织中原位IκBα的表达明显低于携带2758GG或AG基因型患者(方差分析P=0.045)。　　运用荧光素酶(Luciferase)报告基因分析法检测含IκBα基因3-UTR中2758A或2758G质粒的转录活性，发现含2758A报告基因的质粒转录活性明显低于含2758G的报告基因((P值分别是0.022，0.036);加入miR-449a模拟物能够进一步减少含2758A报告基因的质粒的转录活性(P=0.046，P < 0.001)，而加入miR-449a抑制剂能够上调报告基因的转录活性(P=0.003 P < 0.001)。然而，miR-34b模拟物对含2758A或2758G的报告基因转录活性均没有明显影响，提示2758A可能是miR-449a结合位点。　　创新之处：　　本研究发现，NFκB1启动子区-94de1>ins ATTG变异可引起机体肺功能下降速度加快，增加COPD的发病风险;IκBα基因3-UTR的2758G>A变异能影响其与hsa-miR-449a的结合而导致IκBα基因表达降低，从而增加肺癌的发病风险。NFxBl和IxBa基因遗传变异可影响其功能和表达，可能促进炎症反应，从而增加COPD和肺癌的发病风险，提示NFκB1/IκBα基因遗传变异可能是COPD和肺癌的共同遗传易感机制。