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目的:据统计表明,乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤,每年约有138万新发患者,迄今为止已造成4600万患者死亡[1]。在过去的三十年内我国乳腺癌的发病率不断上升,目前已成为女性恶性肿瘤的首位[2,3]。雌激素受体（Estrogen receptor,ER）表达的乳腺癌在欧美占6070%,在我国大约50%。术后应用5年雌激素受体拮抗剂他莫昔芬（Tamoxifen,TAM）每年可降低乳腺癌复发率及死亡率分别为47%及26%[4,5]。他莫昔芬在绝经前后乳腺癌患者中广泛应用,对于乳腺癌患者的治疗非常重要。然而,约三分之一的ER阳性乳腺癌内分泌治疗原发性耐药,几乎全部患者在内分泌治疗一段时间后获得性耐药。他莫昔芬耐药严重影响乳腺癌患者的生存和预后,然而其耐药机制十分复杂,至今尚无突破性进展。因此,深入研究乳腺癌他莫昔芬耐药的机制,具有重大意义。目前,乳腺癌内分泌耐药机制研究的热点主要集中在生长因子及其受体（如人表皮生长因子受体2,即HER-2）,与雌激素受体信号通路之间的调节方面[6-9]。在一般情况下,乳腺癌细胞的雌激素受体（ER）主要在细胞核内发挥作用,而只有少量处于细胞膜上或者细胞质中[10],雌激素与雌激素受体结合后进入细胞核内,通过配体依赖性方式促使细胞增殖[11]。人表皮生长因子受体2（HER-2）异常高表达时,可以造成雌激素受体由细胞核内迁移到细胞膜上[12]。HER-2与ER相互作用（Cross-talk）,通过ER膜受体信号通路活化下游的PI3K和MAPK信号分子,促使核内雌激素依赖性及非依赖性功能转录区均发生活化,并使他莫昔芬由雌激素受体拮抗剂转变为兴奋剂,进而发生他莫昔芬耐药[13-15]。由此可见,ER膜受体信号通路活化是他莫昔芬耐药的重要机制,HER-2与ER在细胞膜上的Cross-talk是耐药发生的必要条件。然而迄今为止,HER-2与ER是如何相互作用的,在什么场所相互作用,又受哪些因素调控并不清楚。脂筏是在细胞膜上不连续分布的、具有特殊功能的微区域。脂筏通过动态聚集、募集及靶向运输作用为蛋白分子相互作用提供功能平台。既往研究证明ER膜受体信号通路的活化需要在脂筏内完成,ER转位于细胞膜后与脂筏相连[13]。抑制脂筏聚集,则ER膜受体信号通路活性被抑制[16]。在转染HER2的MCF-7/HER2细胞,HER-2与ER在脂筏内聚集形成受体复合物[17]。因此,我们推测ER-c-Src-HER-2复合物形成是HER-2介导他莫昔芬耐药的前提,而脂筏是ER-c-Src-HER-2三聚复合物形成和活化的重要场所。另外,研究表明Cbl家族泛素连接酶能够抑制脂筏功能。Cbl家族主要有两个成员,分别为c-Cbl和Cbl-b,这两个泛素连接酶的作用机制主要为通过特定结构识别目标蛋白,促使其发生泛素化及降解来调节靶蛋白功能[18]。泛素连接酶c-Cbl和Cbl-b是脂筏的重要调节蛋白。国外研究显示,Cbl-b通过抑制脂筏聚集抑制T细胞受体等的聚集[19]。我们既往的研究显示,Cbl-b能够清除脂筏内效应因子;我们最近的研究显示,奥沙利铂可以使c-Cbl以及Cbl-b的表达下降,进而促进胃癌细胞内的脂筏聚集,而c-Cbl和Cbl-b的过表达能够抑制胃癌细胞脂筏聚集[20-24]。因此,我们推测c-Cbl可能通过抑制脂筏聚集,抑制ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成进而抑制ER与HER-2之间的串话,逆转他莫昔芬耐药,提高他莫昔芬治疗的敏感性。本课题的研究目的旨在通过一系列体外、体内实验探讨HER-2过表达乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的机制,探讨脂筏在他莫昔芬耐药过程中所发挥的作用,探讨c-Cbl对HER-2过表达乳腺癌他莫昔芬耐药的调控,为临床逆转他莫昔芬耐药寻找潜在的作用靶点。材料与方法1、实验选用HER-2过表达乳腺癌细胞系BT474及HER-2低表达乳腺癌细胞系T47D,利用光学显微镜观察细胞形态。2、采用Western Blot方法检测HER-2,c-Src,ER,PR,c-Cbl,Caveolin-1,Actin等蛋白的表达。3、应用MTT及集落形成方法检测乳腺癌细胞的增殖活性及其对他莫昔芬的药物敏感性。4、采用免疫沉降方法检测蛋白质之间的相互结合。5、采用免疫荧光技术观察乳腺癌细胞表面脂筏的分布情况。6、利用Lipofectamine 2000向BT474细胞内转染HER-2的si-RNA。7、应用酶切法构建3×flagCMV9-c-Cbl过表达质粒,经测序验证后采用Lipofectamine 2000试剂进行转染实验。8、应用慢病毒转染法构建c-Cbl过表达的乳腺癌细胞株。9、利用裸鼠皮下移植瘤模型检测过表达c-Cbl后皮下移植瘤对他莫昔芬的敏感性。10、利用免疫组化方法检测裸鼠移植瘤标本中乳腺癌细胞的蛋白表达情况。11、统计学分析:每个数据均为3次独立实验的结果,最终表示为均数±标准差。实验完成后应用统计学软件SPSS17.0分析,判断实验结果是否具有统计学意义。实验结果1、HER-2过表达乳腺癌BT474细胞对他莫昔芬耐药,而HER-2低表达T47D细胞对他莫昔芬敏感首先,利用MTT方法检测BT474细胞与T47D细胞对于不同浓度他莫昔芬（TAM）的敏感性;进一步,我们又应用集落形成的方法验证了BT474与T47D对他莫昔芬的敏感性差异。结果显示:应用不同浓度他莫昔芬对两种细胞作用72小时后（TAM浓度范围为0.11μmol/L）,T47D细胞系已经看到了明显的增殖抑制,而BT474则表现为相对耐药;集落形成实验与MTT实验表现为同样的趋势,P<0.05,差异具有统计学意义。2、BT474细胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚复合物,而T47D细胞中检测不到该三聚复合物我们应用免疫沉降的方法在BT474细胞系中检测到了ER-c-Src-HER-2三聚复合物的存在。为了进一步模拟体内情况,我们在培养体系中引入了雌激素及他莫昔芬并再次检测ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成情况。结果提示,在耐药细胞系BT474中,不论应用雌激素和/或他莫昔芬处理与否,均可以检测到ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成;而在他莫昔芬敏感的细胞系T47D中则始终不存在这一复合物。3、BT474细胞中,ER-c-Src-HER-2复合物的关键分子HER-2异常活化进一步比较应用雌激素和/或他莫昔芬处理后,两个细胞系中HER-2,c-Src,ER的磷酸化的情况,结果显示,他莫昔芬耐药的细胞系BT474与敏感细胞系T47D相比其主要特征为HER-2信号的异常活化,且不能受到他莫昔芬的抑制。4、抑制脂筏功能干扰ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成应用制霉菌素（Nystatin,终浓度5μg/ml）预处理BT474细胞2小时之后进行免疫沉降,与未应用制霉菌素处理的对照组进行比较,我们发现在应用制霉菌素抑制脂筏功能后,ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成明显减少,同时HER-2信号活化明显减弱。5、抑制脂筏功能逆转BT474细胞的他莫昔芬耐药应用制霉菌素预处理BT474细胞2小时抑制脂筏功能后,再应用雌激素和/或他莫昔芬作用48小时后进行MTT实验,结果发现与未应用制霉菌素处理的对照组进行相比,应用制霉菌素抑制脂筏功能后,BT474细胞对于他莫昔芬的敏感性增强,耐药情况得到部分逆转。另一方面,我们采用集落形成方法,进一步验证了抑制脂筏功能对他莫昔芬敏感性的影响。6、过表达c-Cbl通过抑制ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成,逆转乳腺癌他莫昔芬耐药应用酶切法构建3×Flag CMV9-c-Cbl过表达质粒,经测序验证后,转染BT474细胞进行c-Cbl蛋白的过表达。免疫沉降结果证实,过表达c-Cbl后在BT474细胞中形成的ER-c-Src-HER-2复合物减少;Western Blot检测过表达c-Cbl后BT474细胞的信号通路的变化,结果显示在过表达c-Cbl后BT474细胞的HER-2、ER磷酸化减弱;MTT,集落形成实验实验结果发现过表达c-Cbl后部分逆转了BT474细胞对他莫昔芬的耐药;裸鼠皮下成瘤实验进一步在体内证实过表达c-Cbl可以部分逆转他莫昔芬耐药。结论1、HER-2过表达乳腺癌细胞对他莫昔芬耐药,在他莫昔芬耐药的细胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚复合物;2、抑制脂筏功能减少HER-2过表达乳腺癌细胞中ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成,进而抑制HER-2、ER信号通路活化,逆转HER-2过表达乳腺癌细胞的他莫昔芬耐药;3、过表达c-Cbl可以通过抑制ER-c-Src-HER-2三聚复合物的形成,逆转HER-2过表达乳腺癌细胞的他莫昔芬耐药。