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水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)引起的水稻白叶枯病是影响水稻生产的重要细菌性病害之一;同时水稻-Xoo互作体系已成为植物-病原细菌互作研究的重要模式系统之一。近年来3个Xoo菌株(KACC10331、MAFF311018和PXO99A)全基因组的测序完成为后续研究工作的展开奠定了坚实的基础。Xoo的单根极生鞭毛是菌体主要的运动器官。本室前期研究结果表明,Xoo可能存在着一个以σ54因子(RpoNxoo)和转录激活因子FleQxoo为主控因子的鞭毛合成调控系统。为了进一步阐明Xoo鞭毛基因的级联转录调控系统,本研究通过对PXO99A菌株中鞭毛基因簇中的另一转录调控因子σ28因子(FliAxoo)的分子特征及功能进行了鉴定,明确了鞭毛系统的转录调控机制;同时对鞭毛基因簇中效应调节蛋白(FlgRRxoo)和鞭毛素(FliCxoo)进行了功能鉴定。本研究目的和意义在于阐明Xoo鞭毛合成调控机制,揭示鞭毛素在Xoo侵染水稻过程中发挥的作用,为进一步阐明水稻-Xoo互作的分子机制提供科学依据。σ28因子在多种细菌中参与鞭毛合成调控,但其在Xoo中的调控功能目前尚未有报道。用标记置换法构建了位于野生型菌株PXO99A鞭毛簇中σ28因子编码基因fliAxoo缺失突变体。与PXO99A相比,△fliAxoo鞭毛合成能力丧失,运动性极大减弱,基因互补可使之恢复;但△fliAxoo胞外多糖(EPS)的分泌和纤维素酶、木聚糖酶等胞外酶活性没有变化,对水稻毒性也没有明显改变。表明σ28因子主要参与了鞭毛合成及运动性的调控,与毒性因子分泌及致病性没有直接关系。PXO99A全基因组中存在两套与鞭毛合成有关的基因簇( 2591336-2656886, 2803423-2868973)。这两套鞭毛基因簇虽然位于基因组的不同位置,但其内部各基因的排列次序是基本一致的,分别由PXO-01016 (flgM)至PXO-00954 (cheA)和PXO-06150 (flgM)至PXO-06212 (cheA)之间的各基因组成。虽然两套鞭毛基因簇比较相似,但也存在一定的差异:其中一套鞭毛基因簇由63个基因组成,而另一鞭毛基因簇则由61个基因组成。此外,二者无论组成还是序列完全一致。经生物信息学方法分析,可将Xoo鞭毛基因簇主要组成基因划分为15个转录单元(操纵元),利用Q-RT-PCR方法对rpoN、fleQ、fliA、fliC、fliE、fliD、fliL、fliQ、flhF、fliS、flgB、flgG、flgM、flhB和rbfC等鞭毛基因簇主要基因在3个突变体△rpoNxoo、△fleQxoo和△fliAxoo中的转录进行分析。结果表明,Xoo鞭毛合成的级联转录调控体系可分为三级,受到σ54因子,FleQ及σ28因子的共同调控:其中σ54因子及FleQ位于第一级,是该系统的主调因子;σ28因子的编码基因fliA与fliE、fliD、fliL、fliQ、flhF、flgB、flgG、flgM、flhB、rbfC位于第二级,其转录受到σ54因子和FleQ的正调控;fliC、fliS、flgM位于第三级,受到σ28因子的正调控。双组份信号传导系统(TCS)的应答调节蛋白(RR)是细菌信号调控通路的组成部分,具有REC单一结构域的RR已被证实具有独立且重要的功能。位于鞭毛基因簇σ54因子和FleQxoo之间的调节蛋白FlgRRxoo具有REC单一结构域。为了鉴定其功能,利用标记置换法,构建了flgRRxoo突变体。与PXO99A相比,△flgRRxoo EPS分泌显著减少,对水稻毒性明显降低;但菌体运动性、胞外酶活性没有变化。Q-RT-PCR结果显示,EPS合成基因gumBDGKM在△flgRRxoo中均出现不同程度的下调表达,而rpoNxoo、fleQxoo、fliAxoo基因上调表达。表明FlgRRxoo可能主要通过参与EPS的合成调控,进而影响了致病性,且FlgRRxoo对鞭毛合成主调因子进行负调控。鞭毛素(Flagellin)是鞭毛丝的重要组分,与细菌运动性密切相关;同时,鞭毛素还是一类可以诱导寄主植物细胞发生防卫反应的病原物相关分子模式(PAMP)因子。鞭毛素编码基因fliCxoo位于鞭毛合成级联转录调控体系的第三级。用标记置换法构建了fliCxoo缺失突变体。与PXO99A相比,△fliCxoo鞭毛合成能力丧失,运动性极大减弱;但EPS分泌与胞外酶活性没有变化;对水稻毒性也没有明显改变。表明FliCxoo是菌体保持正常运动能力所必需的,缺失后使鞭毛合成受阻,运动性受到抑制。未发现提取的鞭毛素诱导水稻细胞介质碱化、H2O2产生、细胞死亡率升高等现象的发生,表明PXO99A鞭毛素可能不诱导水稻细胞HR。总之,本研究阐明了Xoo鞭毛合成的三级级联转录调控体系,初步明确了FlgRRxoo对EPS合成及毒性的调控机制,探索了FliCxoo在菌体运动性及在水稻-鞭毛素互作体系中发挥的作用,为今后深入研究水稻-Xoo互作的分子机理奠定了基础。