奶牛乳腺炎是世界公认的奶牛三大疾病之一,长期以来对奶牛养殖业造成的经济损失位居各类疾病之首。大肠杆菌是最常见的引发乳腺炎的病原菌之一,其细胞壁脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）为主要致病因子,能够诱发多种细胞炎症、凋亡与自噬。乳腺上皮细胞是奶牛乳腺组织的主要功能细胞,可通过分泌各种免疫调节因子来抵抗外源病原菌的感染。外泌体（Exosomes）是细胞主动向胞外分泌的小囊泡,可携带蛋白质、脂质或核酸等物质,且在炎症发展与免疫防御过程中发挥重要作用,其中蛋白质作为生命功能的承担者具有一定的组织特异性,差异表达的蛋白质不仅是区分不同来源外泌体的关键所在,也是研究外泌体起源的重要途径。因此,本实验的目的是通过蛋白质组学技术筛选LPS处理奶牛乳腺上皮细胞后外泌体中差异表达的蛋白质,预测奶牛乳腺上皮细胞外泌体中蛋白质的潜在功能,为进一步研究外泌体蛋白质在奶牛乳腺炎中的调控作用奠定实验基础。体外培养奶牛乳腺上皮细胞,用终浓度为20μg/m L的LPS处理奶牛乳腺上皮细胞,收集细胞培养液上清,利用超速离心法提取对照组与LPS处理组细胞培养上清中的外泌体,利用Western Blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63,以及透射电镜、蛋白浓度测定等方法联合对获得的外泌体进行鉴定。利用非标记定量蛋白组学技术分析对照组与LPS处理组蛋白样本,每组三个重复,然后采用Max Quant数据库检索进行质谱数据分析,筛选出差异表达的蛋白质,并对差异蛋白质进行功能聚类、GO及KEGG通路等生物信息学分析。实验结果如下:（1）外泌体的提取与鉴定:所提取对照组和LPS处理组样本蛋白浓度均值分别为0.578μg/μL和0.588μg/μL;电镜下观察样本呈大小较一致的膜泡盘样结构,直径在40-120 nm之间,符合外泌体预期特征;Western Blot结果显示,外泌体表面标志蛋白CD63和CD9结果均为阳性,综上显示成功提取到奶牛乳腺上皮细胞外泌体。（2）蛋白组学分析:在对照与LPS处理两组样本中共鉴定蛋白1 520个,其中相同蛋白1 426个,对照组特异蛋白52个,LPS处理组特异蛋白42个;共筛选出20个差异显著的蛋白质,其中上调蛋白15个,包括钙稳态内质网蛋白、抑制素-2、肽基脯氨酰顺反异构酶、DNA拓扑异构酶2、组蛋白H4、膜联蛋白、肌动蛋白相关蛋白2/3复合亚单位3、肿瘤易感基因101蛋白、蛋白酪氨酸激酶7、四次跨膜蛋白L6家族成员1、微管蛋白β-3链、RAS相关蛋白、睾丸素、髓鞘蛋白零样蛋白1、G蛋白Α抑制活性多肽3;下调蛋白5个,包括溶质载体家族12成员2、酸性磷酸酶-1、纤维蛋白原β链、UDP葡萄糖6-脱氢酶、载脂蛋白C-II;差异蛋白GO和KEGG通路富集分析结果显示,这些差异蛋白主要在细胞外执行蛋白质和RNA结合等功能,参与单生物和细胞蛋白质代谢等过程,涉及Rap1信号通路、内吞作用和肌动蛋白细胞骨架的调节等多个通路。对显著上调TSG101和显著下调UGDH进行验证,发现与蛋白组学鉴定结果一致。综上所述,本研究成功在奶牛乳腺上皮细胞中分离提取出外泌体;明确了外泌体蛋白质的表达谱,对照组与LPS处理组鉴定总蛋白数量1 520个,筛选出20个差异显著的蛋白质,其中上调蛋白15个,下调蛋白5个,主要参与Rap1信号通路、内吞作用和肌动蛋白细胞骨架的调节等过程。证实LPS处理奶牛乳腺上皮细胞后,外泌体中分拣的蛋白浓度升高,蛋白种类也存在差异,为进一步研究乳腺上皮细胞外泌体的免疫调节功能提供了研究基础。