促性腺激素在雌性半滑舌鳎繁殖周期的生理功能研究

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本文以人工养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)为研究对象,运用组织学、内分泌学方法、激素放射免疫测定方法以及分子生物学方法,对半滑舌鳎卵巢发育、促性腺激素(Gonadotropin Hormone, GtH)水平周期变化及其基因的克隆、表达水平等进行了系统的分析与研究,以期进一步阐明GtH的生理功能,为改善工厂化养殖鱼类的生殖调控提供有价值的参考信息。主要研究内容与结果如下:1.半滑舌鳎促性腺激素α亚基(CGα)基因的克隆及其时空表达分析采用RACE方法,从半滑舌鳎脑垂体中克隆了CGα全长cDNA。半滑舌鳎CGα基因全长为685bp,其开放阅读框为384bp,编码了含127个氨基酸的蛋白,N端33个氨基酸为信号肽。半滑舌鳎CGα成熟肽与其它脊椎动物CGα成熟肽结构特征相似,具有10个半胱氨酸残基和2个N-糖基化位点。CGα成熟肽序列分析表明,半滑舌鳎CGα与鲽形目和鲈形目鱼类CGα同源性最高为60-70%。实时荧光定量PCR结果表明,半滑舌鳎CGαmRNA在被检测的12个组织中均有表达,在垂体组织中大量表达,其次是鳃、肾脏、肌肉、卵巢和脑组织,在心脏、头肾、肝和脾等组织中只微量表达;对繁殖周期CGα表达水平进行测定有助于理解鱼类的分子调控机理。RT-PCR结果表明,繁殖周期雌性半滑舌鳎CGαmRNA在Ⅳ、Ⅴ期表达量最丰富。2.半滑舌鳎促滤泡激素(FSH)基因全长cDNA克隆、时空表达利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎FSH基因全长cDNA序列。全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸。发现一个N-糖基化位点:24-27NTT。与其它脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性最高为42-49%。实时荧光定量PCR组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。RT-PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎FSH基因表达水平进行测定,结果表明,FSHmRNA在Ⅳ期表达量最丰富。3.半滑舌鳎促黄体激素(LH)基因全长cDNA克隆、时空表达利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中LH基因cDNA全长序列。该基因全长670bp,开放阅读框为477bp,编码158个氨基酸。与其它脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明:半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58-68%。另外,半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点(19-21NQT)。实时荧光定量组织表达分析表明,LH mRNA在脑、垂体、鳃、心、头肾、肾、肝脏、脾脏、胃、肠、卵巢、肌肉这12组织中均有表达,垂体中表达量最丰富,其他组织尤以脑、性腺表达量较高。推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能;RT-PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定,结果表明,LH mRNA在Ⅳ、Ⅴ期表达量最丰富。4.促性腺激素(GtH)含量测定及周年变化规律利用125I标记的放射免疫测定(RIA)技术检测繁殖周期半滑舌鳎血浆GtH浓度及周年变化规律。结果表明:FSH在繁殖周期的Ⅳ期表达量最丰富;而LH在Ⅴ期表达量最大。雌性半滑舌鳎血浆FSH和LH浓度的周年变化相似,呈现明显的周期性规律,都在9月时出现全年周期中的波峰。统计分析表明,FSH和LH与水温都呈正相关关系,表明调控水温能有效影响半滑舌鳎的生殖内分泌机制。
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