论文部分内容阅读
目的：探讨IL-24与CXCL-13基因在膝关节骨性关节炎发病中的作用及机制,为膝关节骨性关节炎早期诊断、相关药物的开发以及进一步的基因治疗提供科学依据。方法：选择延边地区的年龄>50岁的确诊为原发性膝关节骨性关节炎的滑膜标本,提取总RNA,进行NimbleGen真核生物表达谱芯片检测,明确原发性膝关节骨性关节炎中差异表达基因,用real time RT-PCR法、RT-PCR、免疫印迹分析、免疫组化等方法检测膝关节骨性关节炎滑膜中IL-24与CXCL-13基因及蛋白的表达。用公认的膝关节骨性关节炎的致病因子,TNF-α处理膝关节滑膜细胞,用酶联免疫吸附试验检测经过处理后的滑膜细胞对炎性因子的表达变化,确认膝关节骨性关节炎滑膜细胞模型的建立,用RT-PCR法、免疫印迹分析、激光共聚焦显微镜分析等方法检测IL-24与CXCL-13基因及蛋白的表达变化,并进一步采用临床上被广泛应用于骨性关节炎的治疗药物,塞来昔布处理膝关节骨性关节炎滑膜细胞,检测经处理后的滑膜细胞对IL-24与CXCL-13基因及蛋白的表达变化。结果：1.人骨性关节炎滑膜组织与正常滑膜组织存在明显的基因差异表达：与正常膝关节滑膜相比,膝关节骨性关节炎滑膜中mRNA基因芯片所包含的22885个基因中,上调基因有451个(变化明显的有HOXD10、NGEF、TNFSF7、IGSF10、TNFSF9、ITGA11等),下调基因有810个(变化明显的有CD79A、CXCL13、IL-1Ra、IL-24、 IGF-2、FGF-7等),对基因芯片检测有表达差异的IL-24及CXCL13进行real time RT-PCR检测,结果膝关节骨性关节炎滑膜较正常滑膜IL-24及CXCL13基因表达明显降低,表达差异有统计学意义(P<0.001)。2.扩大病例数进一步验证IL-24及CXCL13在人骨性关节炎滑膜组织与正常滑膜组织中标本中差异表达及其意义：30例膝关节骨性关节炎滑膜组织及22例正常膝关节滑膜组织进行IL-24及CXCL13mRNA的qRT-PCR检测,qRT-PCR结果显示,骨性关节炎组较正常滑膜组织IL-24及CXCL13mRNA的表达量明显降低,表达差异有统计学意义(P<0.001)。Western blot检测结果膝关节骨性关节炎滑膜组织中IL-24及CXCL13蛋白的表达量明显降低,这个结果与基因芯片检测、real timeRT-PCR及qRT-PCR结果相一致。免疫组化检测结果IL-24及CXCL13蛋白在滑膜细胞胞浆中表达,在膝关节骨性关节炎患者的滑膜组织中,IL-24及CXCL13蛋白的表达较正常滑膜组织明显下降。3.利用肿瘤坏死因子在人滑膜细胞HS中建立炎症模型：ELISA法检测可以发现,100U/ml浓度的TNF-α可以诱导人滑膜细胞HS产生炎症,相关的炎症因子IL-6以及TGF-β1随TNF-α作用时间表达升高,而IL-2及IL-10则随TNF-α作用时间增加而表达下降,说明TNF-α可以诱导人滑膜细胞在体外形成炎症模型。4.人滑膜细胞HS炎症模型中IL-24,CXCL13表达明显低于正常人滑膜细胞HS:RT-PCR结果显示,利用炎症刺激因子TNF-a处理膝关节滑膜细胞3h、6h、12h、24h后,随着处理时间的延长IL-24, CXCL13的mRNA水平明显降低,呈时间依赖性降低,表明随着骨性关节炎炎症反应的加重,IL-24, CXCL13的mRNA水平越来越下降。Westernblot分析结果显示,利用炎症刺激因子TNF-a处理滑膜细胞后,随着处理时间的延长,IL-24, CXCL13的蛋白水平明显降低,呈时间依赖性降低,表明随着骨性关节炎炎症反应的加重,IL-24, CXCL13的蛋白表达水平越来越下降,这与RT-PCR结果相吻合。5.塞来昔布可通过上调IL-24及CXCL13抑制炎症反应：RT-PCR结果显示,TNF-a处理24h后,加塞来昔布处理,24h及48h后IL-24及CXCL13mRNA表达均回升。Western blot分析结果显示,TNF-a处理24h后,加Celecoxib处理,24h及48h后IL-24及CXCL13蛋白表达均回升。激光共聚焦显微镜检测结果显示,利用炎症刺激因子TNF-a处理滑膜细胞后,IL-24及CXCL13的蛋白的荧光信号明显降低,表明IL-24及CXCL13的蛋白的表达明显降低,进一步证实,基因芯片检测、RTPCR及Western blot检查结果,塞来昔布处理48h后,IL-24及CXCL13蛋白的荧光信号又有所提升。结论：①膝关节骨性关节炎滑膜组织与正常滑膜组织相比有明显的基因表达差异。②在膝关节骨性关节炎滑膜组织及经TNF-a处理的滑膜细胞中IL-24基因及蛋白表达均明显降低,其表达降低程度与炎症刺激时间呈时间依赖性降低。③在膝关节骨性关节炎滑膜组织及经TNF-a处理的滑膜细胞中CXCL13基因及蛋白表达均明显降低,其表达降低程度与炎症刺激时间呈时间依赖性降低。④塞来昔布有较强的抗炎活性,在膝关节骨性关节炎中塞来昔布不仅通过抑制环氧化酶产生抗炎活性,并且还能通过增强IL-24及CXCL13的表达而缓解膝关节骨性关节炎的症状与体征。