原发性肝癌 (HCC) 是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌死亡率在城市中占恶性肿瘤死因的第二位，在农村占第一位。近年来肝癌的发病率呈上升趋势。全世界每年新发肝癌约 26 万例，而 42.5 %的肝癌分布在中国，中国肝癌死亡率为 20.4/10 万，占全部恶性肿瘤的 18.8 %。原发性肝癌确诊常在晚期，目前尚无有效治疗方法，预后极差。 在我国 HCC 又有其特殊性，即 90 %以上有乙型肝炎病毒感染的血清学证据，乙型肝炎患者发生 HCC 的几率比正常人群高 5-30 倍。环状双股的 HBV DNA 基因组含有 4 个编码病毒蛋白质的基因，这些基因包括：1）三种形式的表面抗原基因(S)；2）核心抗原和 e 抗原的核心基因(C)；3）X 蛋白的 X 基因(X)；4）病毒DNA 聚合酶的聚合酶基因(P)。由于 HBV 基因中的 HBx 片段与 HCC 关系最为密切，较多的关于 HBx 研究主要集中在肝癌致癌这一方面，认为该基因编码的一种多功能蛋白质即 X 蛋白是一种反式激活因子，在促进 HCC 形成的过程中起重要作用。但对转染有 HBx 的肝癌细胞的生物学特征了解不多，X 基因或表达的相应蛋白对肝癌细胞癌基因表达、细胞生长、细胞内外信号转导分子有何影响，目前并不清楚。 我们的前期研究发现生长抑素类似物在体外及裸鼠实验中能显著抑制肝癌的生长，但在人体内的治疗效果则相差甚远。这和多数关于肝癌治疗的研究所选用的细胞模型一样，未考虑 X 基因和 X 蛋白这些特点。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2) 因被认为与人类多种肿瘤的发生、发展有关而成为近年肿瘤研究领域里的热点。转染 X 基因的肝癌细胞内 COX-2 表达发生了什么样的变化？对肝癌细胞生长有什么作用都令人关注。 拉米夫定是一种核苷类似物，是 HBV DNA 聚合酶的抑制剂，已在临床上广泛用于抑制乙肝病毒的复制。该药能否抑制乙肝 X 基因复制、转录和表达，在乙 3<WP=8>重庆医科大学博士学位论文肝后肝癌的治疗上有无协同作用值得探讨。 因此，了解转染有 HBx 的肝癌的生物学特征对乙肝后肝癌的治疗研究将有积极意义。本研究旨在回答下列问题：1．核苷类似物拉米夫定是否能抑制乙肝病毒 X 基因复制、转录和表达？能否作为 研究 X 基因功能的工具之一？2．乙肝病毒 X 基因或 X 蛋白是否影响肝癌细胞生长？3．乙肝病毒 X 基因或 X 蛋白是否影响肝癌细胞癌基因 ras 表达？4．乙肝病毒 X 基因或 X 蛋白是否影响肝癌细胞 COX-2 表达？选择性 COX-2 抑 制剂是否能抑制转染有 X 基因的肝癌细胞的生长及其机制。5．生长抑素类似物是否仍能抑制转染 X 基因肝癌的生长？其机制如何？方法：1． 用 H-TdR 掺入法了解肝癌细胞 DNA 合成。 32． 细胞免疫化学法检测肝癌细胞 PCNA、Ras、COX-2 表达。3． ANNEXIN-V 荧光标记法检测肝癌细胞早期凋亡。4． DNA 末端原位标记染色(TUNEL)法检测肝癌细胞晚期凋亡的情况。5． PCR 法检测 X 基因复制水平的变化；RT-PCR 法检测 X 基因转录水平的变 化。6． 用生物分子相互作用系统检测 X 蛋白变化。7． 用 Western blotting 定量分析肝癌细胞 ERK-1、ERK-2、SSTR-2、SSTR-3、 SSTR-5、Ras、COX-2 表达的改变。结果：1． 拉米夫定组与对照组乙肝病毒 X 基因复制的目的基因条带 OD 值分别是 151.4 4<WP=9>重庆医科大学博士学位论文 ±3.5 和 144.0±11.4，p>.05，无显著性差异。2． 拉米夫定较对照组明显抑制 X 基因的转录，其 mRNA 目的条带的 OD 值分别 为 133.2±7.8 和 243.9±9.0, p<0.01，抑制效应随药物浓度增加和作用时间延 长而增强。经拉米夫定作用后的 HepG2x 细胞的 X 蛋白从 2.36±0.10 RU/μg 蛋白质降至 1.68±0.12 RU/μg 蛋白质，p<0.05。3．HepG2 及 HepG2x 细胞株 H-TdR 掺入值分别为：12969±1364.1 cpm 及 11683 3 ±1283.3cpm，p>0.05。HepG2 和 HepG2x 的 PCNA 表达阳性率分别是 85.3± 2.8 %和 88.5±3.9 %，P>0.05。4．HepG2 及 HepG2x 细胞早期凋亡率分别是 1.53 ±0.49%与 1.61±0.29%，p>0.05， TUNEL 法检测的凋亡指数分别为：1.2±0.84 % 及 1.6±0.55 %，P >0.05。5．拉米夫定对 HepG2x 的 H-TdR 掺入无抑制作用，其 H-TdR 掺入值为 11683 3 3 ±1283.3cpm, 和对照组(11091±529.5)比较，P >0.05；拉米夫定对 HepG2x 的 PCNA 表达也无抑制作用，其阳性率 88.5±3.9 % 和对照组 83.8±5.9 % 比 较无显著差异，P >0.05。6．HepG2x 经拉米夫定作用后，凋亡指数为 3.6±1.0 %，与对照(4.8±2.9 %) 比较， P >0.05。7．转染 X 基因后 HepG2 细胞胞浆内 H-Ras 表达较 HepG2 增强，Western blotting 检测发现 HepG2x 的阳性条带光密度值为 80.8±5.02，明显高于 HepG2 组 51.1±9.06，P <0.05。8．拉米夫定使 HepG2x 细胞 H-Ras 蛋白表达降低，胞浆内染色变浅，HepG2x + 拉 米夫定组 Western blot 阳性条带光密度值为 36.6±3.92 明